Определение маркеров гастроинтестинального статуса.

Грелин. Определение концентрации грелина проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы «Peninsula Laboratories» (США). В процессе анализа стандарты и исследуемые образцы инкубировались в лунках микропланшета, покрытых моноклональными антителами к грелину человека.

Показатели системы про-/антиоксиданты. Для исследования системы «оксиданты-антиоксиданты» у всех пациентов определяли интегральные показатели: содержание перекисей и тиолсодержащих веществ плазмы крови. Оценку тиолового статуса плазмы и содержания перекисей в крови осуществляли, соответственно, с помощью стандартных тест-систем фирм «ImmunDiagnostik» (Германия) и «Biomedica» (Германия).

Перекиси. Для оценки концентрации перекисей использовали метод иммуноферментного анализа и тест-системы «ОхуStat (Peroxides), Biomedica» (Германия). В ячейки микропланшета вносили по 10 мкл контролей, стандартов, образцов. После добавления реакционного буфера А в каждую ячейку, производили первое измерение оптической плотности (ОП1) при 450 нм После внесения 100 мкл ABC-реакционной смеси (буфер для разведения, ТМБ, пероксидаза хрена) инкубировали 15 мин. при температуре 37°С.

(ОП2 - ОШ)/концентрацию стандарта/АОП стандарта Тиол со держащие соединения. Определение концентрации

тиолсодержащих соединений проводили с помощью стандартной тест-системы фирмы «ImmunDiagnostik» (Германия). В ячейки микропланшета вносили по 20 мкл сыворотки, калибратора, добавляли по 200 мкл реакционного буфера А (буфер для разведения) во все ячейки и измеряли оптическую плотность (ОП1) при 405 нм. Затем во все ячейки вносили по 20 мкл реакционного буфера В, инкубировали 30 мин при 37°С и измеряли оптическую плотность (ОП2) при 405 нм на микропланшетном ридере. Концентрацию тиолсодержащих (мкмоль/л) соединений в плазме крови рассчитывали в мкмоль/л по формуле:

(ОП2-ОП1)хконцентрацию калибратора/АОП калибратора Определение уровня ингибитора активатора плазминогена 1 типа. Данный метод основан на иммуноферментном анализе с использованием двухшагового сэндвич-анализа и тест-системы «Technoclone PAI-I ELISA» (Австрия). В процессе анализа стандарты и исследуемые образцы инкубировались в лунках микропланшета, покрытых моноклональными антителами к ИАП-1 человека. После одночасовой инкубации и тщательной промывки в лунки с иммобилизованным комплексом антитела-ИАП-1 добавляли биотинилированные поликлональные антитела к ИАП-1 человека. После второй инкубации и процедуры промывки в лунки вносили конъюгат стрептавидина с ферментом пероксидазой хрена. После одночасовой инкубации и тщательной промывки в лунки вводили субстрат ТМБ. Реакция останавливалась при помощи кислоты, и абсорбция получившегося желтого раствора определялась спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Абсорбция была пропорциональна концентрации ИАП-1 в исследуемом образце. Калибровочная кривая строилась с использованием значений ОП, полученных для стандартов ИАП-1, поставляемых с набором. Концентрация резистина в исследуемых образцах и контролях определялась непосредственно по калибровочной кривой.