Маркеры опухолевых изменений в нервных тканях, доступные для анализа методами оптической спектроскопии

Как показали исследования (Stummer et al., 2008; Roberts et al., 2011), содержание Пп IX в глиальных опухолях головного мозга является высокоспецифичным критерием для демаркации границ опухоли, а также определения степени ее озло- качествления (Gibbs-Strauss et al., 009).

Пп IX характеризуется достаточно высоким квантовым выходом флуоресценции, что в сочетании с его свойством селективно накапливаться в клетках, характеризующихся ускоренным делением, обуславливает популярность его использования в качестве опухолевого маркера. При этом спектр поглощения Пп IX достаточно широк, чтобы можно было использовать почти любой диапазон видимого спектра для возбуждения его флуоресценции.

Однако в 30% случаев наблюдается лишь незначительное накопление препарата в опухолевых клетках (Potapov et al., 2011), что обусловлено рядом факторов, таких как уровень глюкозы, насыщение тканей кислородом, уровень кислотности, стадия клеточного цикла (Pogue et al., 2010). Также в исследовании (Valdees et al., 2011а,Ь) было показано, что значительное число образцов ткани (около 40%), содержавшее 5-АЛК-индуцированный протопорфирин IX в концентрации не ниже 0,1 мг/мл, не визуализировалось с помощью используемого для интраоперационной навигации видеофлуоресцентного микроскопа.

В связи с вышеперечисленными факторами, затрудняющими интраоперационную навигацию с использованием 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX, необходимы дополнительные критерии для интраоперационной диагностики исследуемых тканей. Одним из наиболее широко используемых прогностических критериев при определении степени озлокачествления опухоли является изменение сосудистой структуры и, как следствие, - кровенаполнение опухоли, определяемое, как правило, посредством предоперационной МРТ.

При рассмотрении структурных изменений, происходящих в нервных тканях с развитием глиальных опухолей, необходимо учитывать тот факт, что их основной характеристикой является рост вдоль миелинизированных нервных волокон и кровеносных сосудов без формирования капсулы, что приводит к инфильтрации нормального белого вещества головного мозга опухолевыми клетками (Brat, 2004). На органо-тканевом уровне организации глиальные опухоли состоят из центральной и перифокальной зон (Giese et al., 2003; Tonn, Goldbrunner, 2003) и приводят в процессе развития к смещению, отклонению и разрушению нервных трактов. Центральная зона мультиформной глиобластомы (наиболее злокачественная форма глиальных опухолей) характеризуется развитием некроза в ядре опухоли с сопутствующими деструктивными изменениями миелинизированных нервных волокон (Brunberg et al., 1995; Sinha et al., 2002). Опухоли без некроза в центре и отека в перифокальной зоне, такие как доброкачественные глиомы (стадии I-II по классификации ВОЗ) или анапластическая астроцитома (стадия III), как правило, имеют более однородную структуру по всему объему.

На масштабном уровне тканевой организации следует также учитывать количество и форму клеточных мембран. Как известно, около 50% белого вещества составляют миелиновые оболочки нервных трактов, представляющие собой многослойные мембраны, состоящие из липидного бислоя (70-85% сухого вещества) с протеиновыми включениями (15-30%) (Johansen-Berg, Behrens, 2009; Brady et al., 2011), что обуславливает высокий показатель преломления этой структуры.

На клеточном уровне мультиформная глиобластома (стадия IV) проявляет такие свойства, как плотноклеточность, атипическое развитие ядер, рост их размеров и плеоморфизм (разнообразие форм) (Candolfi et al., 2007). Анапластическая астроцитома, располагающаяся в системе классификации ближе к категории злокачественных, характеризуется повышением клеточной плотности, анаплазией и митозами, однако в меньшей степени, чем глиобластома. Доброкачественные опухоли проявляют умеренное повышение плотности клеток и увеличение размера ядер без проявления клеточной атипии и митотической активности (Schiffer, 2006; Sarkar et al., 2009).

На субклеточном уровне наиболее критические изменения происходят с содержанием и структурой митохондрий. В нормальной ткани митохондрии составляют порядка 7-8% от объема клетки (Pysh, Khan, 1972; Beauvoit et al., 1995). Было показано, что в ткани печени митохондрии оказывают существенное влияние на рассеяние света клеткой (Beauvoit et al., 1994; Beauvoit, Chance, 1998). Работы посвященные структурному анализу митохондрий в клетках астроцитарных опухолей посредством электронной микроскопии (Gabriel, 2011; Oudard et al., 1997), показали высокую гетерогенность их расположения в клетке, частичное или полное разрушение крист и уменьшение числа митохондрий.

Кроме того, диагностику состояния тканей, а именно - выявление мультиформной глиобластомы, наиболее часто встречающейся (до 52% первичных опухолей мозга и до 20% всех внутричерепных опухолей) опухоли мозга (Смирнова и др., 2004; Борисов, Сакаева, 2011), можно осуществлять путем определения типа клеточной гибели.

Еще одним параметром, позволяющим диагностировать наличие раковых клеток, является более интенсивная аутофлуоресценция внутриклеточного НАДН, возбужденная УФ-излучением (Uppal, Gupta, 2003; Villette et al., 2006). Кроме того, было показано, что время жизни и интенсивность аутофлуоресценции клеточных НАДН и ФАД также являются критерием для обнаружения метаболитов клеток на ранних стадиях развития рака. Стоит, однако, отметить, что в зависимости от типа ткани интенсивность флуоресценции в патологической ткани по сравнению с нормой может как увеличиваться (Sinha et al., 2002), так и уменьшаться (Kirkpatrick et al., 2005). Таким образом, явление зависимости аутофлуоресценции НАДН от расположения и развития опухоли в ткани требует дальнейшего изучения. Тем не менее, очевидно, что эндогенные флуорофоры, такие как НАДН и ФАД, могут являться молекулярной мишенью для диагностики онкологических заболеваний, в том числе на ранней стадии.

НАДН и ФАД являются важнейшими метаболическими ко-ферментами мозга (Shen, Lin, 1993), и изменение их концентраций в тканях мозга всегда обусловлено возникновением патологии. Следовательно, определение концентраций НАДН и ФАД путем измерения аутофлуоресценции может служить способом диагностики процессов жизнедеятельности биологических тканей мозга, в частности, по изменениям концентраций этих метаболитов можно определить начало процесса канцерогенеза (Drezek et al., 2001; Ramanujam et al., 2001; Zhang et a1; 2004). Существенным плюсом такого способа диагностики является возможность недеструктивного мониторинга концентрационных изменений с помощью оптических методов. Такая методика измерения интенсивностей аутофлуоресценции НАДН и ФАД и оценки состояния тканей и динамики протекающих процессов по изменению количественного соотношения интенсивностей была предложена еще во второй половине XX века (Chance et al., 1979). Полученное отношение позволяет качественно оценивать уровень клеточной метаболической активности, и очевидно, что уменьшение этого показателя может являться критерием для выявления раковых клеток.

3.