Методы количественного определения нейроспецифических белков и маркеров межклеточного матрикса

Определение содержания нейроспецифических белков в сыворотке крови.

Белок S-100 (нг/мл, оптическая плотность (ОП 620 нм)

Стандарты и образцы сывороток крови инкубируют вместе с биотинилированными моноклональными антителами к белку S-100 в покрытых стрептавидином ячейках микрoпланшета.

Цилиарный нейротрофический фактор, CNTF (пг/мл, ОП 620 нм)

Стандарты и образцы сыворотки крови инкубируют в лунках в присутствии иммобилизованных антител к CNTF. После промывания несвязанного вещества образец инкубируют с поликлональными антителами, специфичными к CNTF. После удаления несвязанных антител в раствор добавляют субстрат/фермент, вызывающий ферментативную реакцию, сопровождающуюся окрашиванием образцов, которое соответствует количеству связанного CNTF на начальной стадии.

Основной белок миелина, MBP (нг/мл, ОП 450 нм)

Калибраторы, контроли и тестируемые образцы инкубируют в лунках микропланшета, покрытых антителами к MBP. После инкубации и промывки в лунки вносят детектирующие бштинилированные антитела к MBP. После второй инкубации и промывки в лунки вносят стрептавидин, конъюгированный с HRP. После третьей инкубации и промывки лунки инкубируют с субстратом ТМБ. Конъюгат антитела-биотин связывается с комплексом антиген-антитело, фиксированным на дне лунок микропланшета, а также с конъюгатом стрептавидин-фермент.

IgM-аутоантитела человека к миелин-астциированному гликопротеину, anti-MAG (единицы титра анти-MAG аутоантител, ОП 450 нм)

Стандарты и сыворотку пациентов инкубируют в течение 2 часов в лунках микропланшета с анти-MAG аутоантителами, присутствующими в образцах или стандартах. В результате промывки удаляют все несвязавшиеся компоненты, затем добавляют антитела к IgM человека, конъюгированные с HRP и инкубируют еще в течение 2 часов. После этапа промывки добавляют раствор субстрата, содержащий ТМБ и инкубируют еще 30 минут. Интенсивность развивающегося голубого окрашивания пропорциональна количеству анти-MAG аутоантител, связавшихся на начальном этапе. Развитие окраски останавливают добавлением стоп-раствора кислоты, в результате чего голубое окрашивание сменяется желтым. Измеренная абсорбция прямо пропорциональна концентрации анти-MAG аутоантител. Панель стандартов анти-MAG аутоантител используют для построения калибровочной кривой абсорбции против единиц титра анти-MAG аутоантител, из которой рассчитывают концентрации анти-MAG аутоантител человека в образцах сыворотки пациентов.

Фосфорилированный нейрофиламент - Н, pNF-H (пг/мл, ОП 450 нм)

Стандарты, контроли и образцы инкубируют в стрипах, предварительно покрытых куриными поликлональными анти-pNF-H антителами. После 60 минут инкубации и промывания, вносят кроличьи поликлональные анти-pNF-H антитела. После второй инкубации и промывания добавляют HRP, что приводит к образованию HRP конъюгата. Затем вновь после инкубации и промывания добавляют субстрат ТМВ. Реакцию останавливают добавлением кислого раствора и поглощение полученного желтого продукта измеряют спектрофотометрически.

Нейротрофин-3, NT-3 и нейротрофин-4/5, NT-4 (пг/мл, ОП 450 нм)

Стандарты и образцы вносят в лунки с иммобилизованными на поверхности антителами к NT-3 (4/5) и инкубируют с последующим промыванием. Затем в лунки вносят биотинилированные антитела против человеческого NT-3 (4/5). После отмывания несвязанного биотинилированным антителом остатка, вносят HRP-конъюгированный стрептавидин. После инкубации лунки снова промывают, дoбавляют раствор субстрата TMB и фиксируют изменения цвета, пропорциональные количеству NT-3 (4/5) в образцах.

Определение содержания маркеров состояния межклеточного матрикса в сыворотке крови.

Матриксная металлопротеиназа-2, ММР-2 (нг/мл, ОП 450 нм)

В ходе реакции в лунки планшета добавляют стандарты и образцы. MMP-2, присутствующая в образце, связывается с иммобилизованными антителами. После промывки несвязавшиеся компоненты удаляют и в лунки добавляют поликлональные антитела (конъюгат) к MMP-2. После второй промывки и удаления несвязавшегося конъюгата фермент-антитела добавляют в субстратный раствор, который взаимодействует с ферментом с образованием цветного комплекса. Интенсивность окраски последнего прямо пропорциональна концентрации MMP-2, присутствующей в образце. Цветную реакцию останавливают стоп-раствором и интенсивность окраски измеряют на планшетном фотометре.

Матриксная металлопротеиназа-9, MMP-9 (нг/мл, ОП 450 нм)

После инкубации при промывке из ячеек удаляют несвязавшиеся вторые анти-ММР-9 антитела. В ячейки добавляют конъюгат антител к IgG кролика с перoксидазой хрена (анти-IgG-HRP), который связывал вторые антитела к человеческой MMP-9. После инкубации и промывки из ячеек удаляют несвязавшийся ферментный ^нъюгат и в ячейки добавляют субстратный раствор, который взаимодействовал с ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора.

Тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы 1, TIMP-1 (пг/мл, ОП 450 нм)

После инкубации и промывки из ячеек удаляют несвязавшийся биотиновый конъюгат анти-ТІМР-1 и в ячейки добавляют конъюгат стрептавидин-перoксидаза (стрептавидин-HRP), связывающий биотин, конъюгированный с анти-ТІМР-1 антителами. После инкубации и промывки из ячеек удаляют несвязавшийся стрептавидиновый конъюгат и в ячейки добавляют субстратный раствор, который взаимодействовал с ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации TIMP-1, присутствующего в образцах. Концентрацию TIMP-1 в образцах определяют по стандартной кривой, построенной по 7 приготовленным разведениям стандарта.

2.2.