Методы актериологического исследования планктонных и пленочных культур

Полученные от пациентов с бронхолегочными осложнениями образцы биологических субстратов размазывают по стерильному предметному стеклу и окрашивают по Граму, нанося на обезжиренное стекло каплю воды, в которой суспендируют культуру.

Посев биологического материала осуществляют на 5%-ный агар (E.coli, Ps. aeruginosa, St. aureus) и Chromagar TM (C.albicans) путем равномерного распределения по поверхности питательной среды с использованием дозаторов с последующей инкубацией в суховоздушном термостате ТС-1/80 СПУ в течение 24 час. при температуре 37°С (для E.coli, Ps. aeruginosa, St. aureus) и в течение 72 час. при температуре 22°С (для C.albicans). Из материала изолированных колоний, отобранных по культурально - морфологическим признакам, выделяют чистые культуры.

Биохимическую идентификацию штаммов осуществляют на микробиологических анализаторах (рис.1).

Рисунок 1. Микробиологические анализаторы.

Для количественного учета интенсивности пленкообразования из суточных культур исследуемых штаммов в стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида готовят суспензии с оптической плотностью 0,5 по МакФарланду (рис.

Рисунок 2. Прибор для определения мутности бактериальной суспензии.

Вносят по 100 мкл бактериальной суспензии с начальной концентрацией бактерий 10⁵ КОЕ/мл в ячейки плоскодонных стерильных культуральных полистирольных планшетов с 96 лунками (рис. 3), содержащие в каждой лунке ряда по 100 мкл питательного бульона для культивирования микроорганизмов (ПД-бульона), состоящего из 9 г пептона ферментативного сухого, 8 г гидролизата казеина ферментативного, 3 г дрожжевого экстракта, 5 г натрия хлорида, 2,5 г натрия гидроортофосфата (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, Россия) или 100 мкл питательного бульона Сабуро, состоящего из 10 г пептона сухого ферментативного, 40 г глюкозы, 15 г агара микробиологического и натрия фосфорнокислого однозамещенного.

Рисунок 3. Микропланшет для культивирования биопленок

Бактериальную суспензию E.coli, Ps. aeruginosa, St. aureus инкубируют в суховоздушном термостате (статические условия) при температуре 37°С в течение 24, 48, 72 и 96 час., C.albicans - в течение 24, 48, 72, 96 и 120 час. Планктонные бактерии удаляют аспирацией, ячейки планшетов осторожно промывают с помощью автоматического многофункционального промывателя для микропланшет, добавляют соответствующий объем 1%-ного водного раствора красителя кристаллического фиолетового, экспонируют при комнатной температуре 10 минут, удаляют раствор и осторожно троекратно промывают планшеты водой. Связавшийся с биопленками краситель растворяют в 200 мкл смеси ацетон: этанол (20 мл : 80 мл) и определяют на спектрофотометре ОП при длине волны 420 нм. Для построения калибровочной кривой готовят контрольные образцы (200 мкл смеси ацетон: этанол (20 мл: 80 мл), внесенной в ячейки планшетов с ОП 0,1 по МакФарланду.

Количественный учет пленкообразования клиническими штаммами микроорганизмов оценивают на спектрофотометре для микропланшет по

величине связывания ими кристаллического фиолетового (ед.

стерильных плоскодонных культуральных полистирольных планшетах на 96 лунок.

В качестве группы сравнения используют тестовые штаммы условно-

патогенных микроорганизмов и патогенных грибов: (рис. 4-7).

Рисунок 4. MICROCONTROL DISCS, АТСС 25922 Escherichia coli

Рисунок 5. MICROCONTROL DISCS, АТСС27853 Ps.aeruginosa

Рисунок 6. MICROCONTROL DISCS

АТСС 25923 St.aureus

Рисунок 7. Паспорт штамма Candida albicans АТСС 885-653. Получен из ЛСК ГИСК им. Л.А. Тарасевича 31.01.1997

Для контроля используют определение ОП 200 мкл смеси ацетон: этанол (20 мл: 80 мл), внесенной в лунки плоскодонных микропланшетов.

Затем осуществляют атомно-силовую микроскопию (АСМ) с применением зондовой нанолаборатории. Сканирование осуществляют в полуконтактном режиме с применением зондов с резонансной частотой колебаний балки 107 кГЦ. Размеры областей сканирования соответствуют 40x40 мкм и 10χ 10 мкм.

4.2.