2.2 Методы исследования

При анализе и исследовании материалов использовали комплекс паразитологических, вирусологических, сероэпидемиологических, генетических и статистических методов.

2.2.1 Паразитологические методы

Основаны на прямом морфологическом выявлении трофозоитов и пневмоцист в биологическом материале (легочной ткани, бронхоальвеолярном лаваже, индуцированной мокроте) при световом микроскопировании.

Из полученного материала готовили мазки, высушивали, фиксировали этиловым 96⁰ спиртом. Окраску мазков производили по методу Романовского-Гимза, в силу того, что он способен выявлять как трофозоиты, так и пневмоцисты (54). Этот метод доступен при массовых исследованиях.

2.2.2 Вирусологические методы

Трипсинизированные культуры клеток (ДККМЧ) ресурспендировали в среде Игла МЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота из расчета 200000 – 250000 клеток в 1 мл, заселяли в стерильные флаконы различной емкости и пробирки со стеклами и инкубировали при 37⁰ С до образования 50-80% монослоя. Вируссодержащую жидкость наносили на клетки из расчета 10 ТИД вируса на 1 клетку. Адсорбцию вируса проводили при 37⁰ С в течение 1 часа, после чего культуры заливали поддерживающей средой (Игла МЕМ с 1 – 2% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота). Зараженные клетки инкубировали при 37⁰ С.

2.2.3 Сероэпидемиологические методы

Разработаны тест-системы для ИФА на твердой фазе, с использованием полученных нами антигенов (P. carinii и ЦМВ штамм «Весна», штамм АD–169), позволяющие выявлять антитела к P. carinii и ЦМВ классов IgG и IgM , для определения антигенов к P. carinii и ЦМВ были использованы разработанные автором экспериментальные тест-системы для НРИФ.

При расшифровке этиологии острых пневмоний и других заболеваний применяли тест-системы для определения антител к вирусам гриппа А,В и С парагриппа I, II, III типов, аденовирусам, РС-вирусу, M.

2.2.4 Молекулярно-генетический метод полимеразной цепной

реакции (ПЦР)

Качественное и количественное определение ДНК ЦМВ в крови, ликворе, тканях пораженных органов осуществляли методом ПЦР. Исследования были выполнены Шипулиной О.Ю., Шахгильдяном В.И. и Шипулиным Г.А. по разработанной ими методике (46). Для определения титра ДНК ЦМВ готовили 4 10-кратных разыедения исходного лизата, содержащего ДНК из 10⁶ лейкоцитов в 100 мкл. Проводили реакцию амплификации с каждым разведением, включая исходный лизат. Наличие ПЦР-сигнала только в исходной пробе соответствовало минимальному титру ДНК ЦМВ (1:1), в исходной пробе и первом разведении – низкому (1:10), в 2 разведениях – среднему (1:100), в 3 – высокому (1:1000).

Подтверждением ЦМВ-поражения органов считалось обнаружение в измененных тканях цитомегалических клеток (ЦМК).

2.2.5 Статистические методы

Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами параметрической статистики (1), в том числе с использованием пакетов программ “Statgrat” и “Excel”.

Объективная оценка результатов титрования в серологической практике проводилась по методике предложенной В.И. Васильевой и соавторами, в основу которой был положен метод Mathiesen (48).