2.3.1 Молекулярно-микробиологические методы

Для определения качественного и количественного состава микроорганизмов в пародонтальных карманах использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Исследования проведены на базе научно−исследовательской лаборатории «Диагностика».

Пробы для микробиологического исследования пародонтального кармана осуществляли согласно протоколу выполнения забора материала Международной Организации Стандартов (ISO), принятому Ассоциацией специалистов микробиологов и Американской организацией по контролю за качеством Bacteriological Analytical Manual (BAM, 1986).

Для изучения микрофлоры пародонтальных карманов удалены наддесневые зубные отложения. В область самых глубоких зубодесневых карманов вводили до дна кармана по 3 стерильных эндодонтических бумажных

штифта (ISO 35). Через 10 секунд штифты переносили в контейнер с анаэробной транспортной средой.

Из материала выделяли тотальную ДНК при помощи набора для выделения

«ДНК-сорб В» (АмплиСенс, Россия) соответственно инструкции производителя. Для количественного анализа анаэробной микрофлоры рта использовали метод ПЦР в реальном времени со специфическими праймерами и Taqman-зондами. Реакция ПЦР была выполнена в буфере, содержащем 67 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 17 мМ (NH₄)₂SO₄, 2,5 мМ MgCl₂, 0,1% Tween-20, 0,12 мкг БСА, 8% глицерола, с 200 мкМ каждого дезокситрифосфата, 15 пмоль каждого праймера и зонда, 2,5 U Tag ДНК-полимеразы (Силекс, Россия) (таблица 5). В качестве матрицы использовали 5 мкл выделенного образца ДНК [116]. Амплификация выполнена на приборе MiniOpticon (Biorad, США) по программе: первичная денатурация при

94 С в течение 2 минут, последующая амплификация в течение 45 циклов при 94

С 30 секунд, 60 С 30 секунд, 72 С 30 секунд. Количественная оценка осуществлялась по методу сравнения кинетики накопления сигнала в исследуемых образцах с кинетикой накопления сигнала в стандартных калибровочных образцах с известным количеством ДНК-мишени.

Таблица 5 – Праймеры для проведения молекулярно-микробиологического исследования содержимого ЗДК методом ПЦР в реальном времени