Микробиологические методы исследования

Материалом исследования являлись штаммы S. pneumonia,полученные из носоглоточных смывов, которые собирались в медицинских пунктах дет­ских спортивных школ.

Для изучения микрофлоры глотки и носа материал забирался стериль­ным ватным тампоном, который отмывался в пробирках с 2,5 мл 1% пептон­ной воды.

Материал из каждого разведения засевался на поверхность питатель­ных сред - 5% кровяной агар, среда Эндо, ЖСА, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 -72 часов в зависимости от искомых видов микроорга­низмов.

Для выявления грибковой флоры из первого разведения делался посев на среду Сабуро в объеме 0,1 мл с последующей инкубацией при 25°С в те­чение 3-5 суток.

Количественный учёта общей плотности популяции различных видов проводился путем подсчета КОЕ на тампон на 5% кровяном агаре. Отдельно учитывались колонии с гемолитическими способностями (с α, 3-гемолизом). Из этой группы проводился отбор колоний для родовой и видовой идентифи­кации.

Грамотрицательная флора оценивалась при росте на среде Эндо, ста­филококков - на ЖСА, грибковой флоры - на среде Сабуро.

Количественный учет колоний проводился в 3-х каплях одного из раз­ведения, там, где был получен отчетливый рост изолированных колоний. Число КОЕ, высеваемых с одного тампона, рассчитывалось по формуле:

10ⁿ

3

где А - число КОЕ на тампон для отдельных групп бактерий, а1+а2+а3 - число колоний, выросших в 3 просчитываемых каплях од­ного разведения, n - номер разведения, 2 - коэффициент перерасчета.

Бактериологическая идентификация выделенных культур прокориоти- ческих микроорганизмов проводилась с использованием тестовых признаков, предложенных определителем бактерий Берджи, а также с использованием MALDI TOF масс спектрометрии.

Идентификации S.pneumoniaeпроводилась на основе изучения морфо­логии колоний, альфа-гемолиза, чувствительности к оптохину, лизиса в при­сутствии солей желчи (10% раствор дезоксихолата натрия) (рисунок 5, 6).

Рисунок 5- Оптохиновый тест

Рисунок 6 - Тест с желчью

Штаммы S.pneumoniaeсохранялись в мясопептонном бульоне с добав­лением 30% стерильного глицерина при температуре 80^о С.

Исследование антагонистической активности S. pneumonia,выделен­ных из одного и того же биотопа, в отношении других членов биотопа про­водилось по методике Д.М. Мельникова (1989) [108].

На чашку с кровяным агаром засевали газоном одну из исследуемых культур. Затем на засеянный газон накладывали стерильный диск (б-1,7см) из плотной фильтровальной бумаги и на каждый диск наносили каплю суточной бульонной культуры S. pneumonia.Через 15-20 минут после подсушивания чашки термостатировали в течение 18-20 часов. Сплошной рост вокруг диска указывал на симбиотические отношения, при образовании зоны подавления роста - как антагонистические.

Оценку микробиоценоза верхних дыхательных путей проводили путем определения доминирования вида в микробиоте зева и носа с использовани­ем показателя индекса доминирования (D), предложенного И. Балогом (1958), в модификации Симпсона [108 c.468].

Для определения доли участия разных видов в структуре биоценоза ис­пользовался показатель постоянства вида, который рассчитывался по форму­ле:

где С - доля вида в сообществе в %, р - число выборок, содержащих данный вид, Р- общее число взятых образцов.

В зависимости от полученных значений, виды подразделялись на по­стоянные - присутствовавших более чем в 50% образцов, добавочные - в 25% - 50% и случайные - менее чем в 25% выборок.

Разнообразие видов в биотопах оценивалось по формуле:

где d - коэффициент разнообразия, S - количество видов в сообществе, N - общая микробная плотность.

Равномерность распределения видов в сообществе (Е) высчитывалась по формуле:

где S - количество видов, n₁- значимость для наиболее значимого вида (КОЕ на см²/мл, г),

n_s- значимость для наименее значимого вида (КОЕ на см²/мл, г).

Для оценки влияния S. pneumoniaна биоценоз носоглотки использовал­ся показатель сравнения встречаемости двух видов в биотопах с использова­нием коэффициента сопряжённости Коули г 1 0QT

где С - коэффициент Коули, А - число биотопов с видом А и В вместе, В - биотопы с видом А без В, С - число участков с видом В без А, Д - число биотопов без видов А и В.

Индекс доминирования (D) в структуре сообщества высчитывался по формуле:

где Р - встречаемость данного вида в сообществе, N - средняя плот­ность сообщества.

2.3