ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

Важная задача эпидемиологии состоит в выявлении скрытых механизмов развития эпидемий и их подготовки. Решение этой задачи становится воз­можным благодаря современным методам анализа.

Молекулярная эпидемиология изучает молекулярные механизмы популя­ционных перестроек, т. е. предвестники эпидемиологических проявлений. Кро­ме того, в задачи молекулярной эпидемиологии входит разработка методов слежения за распространением возбудителя.

Возникновению нового направления в эпидемиологии способствовал ряд обстоятельств. Во-первых, возрастание роли массовых обследований в профи­лактике заболеваний. Во-вторых, бурное развитие молекулярной биологии и генетики, сделавшее возможным непосредственное изучение распределения генов в популяциях, а также фенотипических признаков. В-третьих, становле­ние новой теоретической концепции эпидемиологии, предполагающей учет внутренних механизмов развития эпидемического процесса.

Современные теоретические обобщения эпидемиологии позволяют пред­сказывать и анализировать скрытые явления, не подлежащие непосредствен­ной регистрации. Полученные выводы нуждаются в строгом лабораторном подтверждении. Молекулярно-эпидемиологический анализ в совокупности с углубленным анализом заболеваемости и составляет ядро эпидемиологиче­ского метода исследования.

Молекулярная эпидемиология тесно связана с молекулярной генетикой патогенных микроорганизмов. В настоящее время установлены два типа из­менчивости микробных популяций: внутриклональная и межклональная. Межклональная изменчивость основывается на размножении ис­ходно неоднородной популяции и поддерживается генетическим обменом. Внутриклональная изменчивость обеспечивается процессами ге­нерации неоднородности за счет генетических перегруппировок.

В определенных условиях активизируются наиболее опасные «линии» воз­будителей, что определяет последующую неблагоприятную эпидемическую обстановку и циклические подъемы заболеваемости.

Адаптационная изменчивость клонов возможна лишь в определенных пределах, не нарушающих сбалансированность генотипа. Направленность из­менчивости связана с распределением мигрирующих элементов и других регу­ляторных структур в различных участках генома. В пределах биологического вида имеются адаптирующиеся «линии» микроорганизмов, представленные совокупностью «родственных» клонов.

Исследование межклональной изменчивости важно для понимания меха­низма ранних стадий развития эпидемического процесса. Эффективно цирку­лирующие микроорганизмы могут приобретать дополнительные гены, напри­

мер антигенности, токсигенности, за счет процессов генетического обмена. Рекомбинация циркулирующих вирусов гриппа А человека с персистентными антигенными анахронизмами способствует образованию эпидемических ва­риантов вируса.

У бактериальных клеток установлена мобилизация «резерва генов», т. е. внутриклональная изменчивость. Так, в геноме Neisseria gonorrhoeae содержит­ся несколько нефункционирующих копий гена пилина — белка, ответственного за адгезию. Рекомбинация между этими генами и основным дефектным ге­ном, находящимся в сайте экспрессии, приводит к восстановлению полноцен­ного гена, образующего функционально активный пилин. Этот механизм, как и рекомбинация у вирусов, способствует одновременно приобретению виру­лентности и антигенной изменчивости.

Адаптация микроорганизмов основывается на точечных и блочных пере­стройках в определенных локусах генетического аппарата.

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ЭПИДЕМИОЛОГИИ

Методический арсенал любой науки предполагает непосредственное из­учение явлений, их моделирование и прицельное конструирование. К спе­циальным методам, применяемым в эпидемиологии, относятся следующие.

1. Микробиологическое и иммунологическое слежение за развитием эпи­демического процесса.

2.

3. Математическое моделирование популяционной изменчивости и эпиде­мических ситуаций.

4. Конструирование вакцинных штаммов с заданными свойствами и на­правленное создание других противоэпидемических средств.

Все эти методы различны по содержанию, но имеют общую молекуляр­но-биологическую основу. Большой информативностью для практики отли­чаются методы молекулярных исследований, с помощью которых изучают выделенные штаммы возбудителей.

Эти методы делятся на молекулярно-генетические и молекулярно-биоло­гические. Молекулярно-генетические методы направлены на изуче­ние генома возбудителей, а молекулярно-биологические — на выя­вление фенотипических признаков. Различают скрининг-методы и методы углубленных исследований. При помощи первых мож­но проанализировать большое количество изолятов, а последних — лишь ограниченное их число в связи с большей детализацией и сложностью иссле­дования. Методы молекулярного анализа можно группировать в соответствии с принципом, положенным в основу выявления конечного результата (исполь­зование радиоактивных изотопов, иммуноферментной индикации и др.).

C помощью скрининг-методов можно проводить массовые обследования с изучением изолятов возбудителей. В последующем отдельные варианты от­бираются для углубленного анализа с целью выявления генетических пере­группировок.

Прогресс современной молекулярной эпидемиологии связан с появлением быстрых и качественных методов скрининга внехромосомных элементов (плазмид) у бактерий (лизис, очистка ДНК плазмид, электрофорез в агароз­ном геле).

В настоящее время плазмиды (дополнительные кольцевые молекулы ДНК) обнаружены у значительного количества патогенных и условно-пато­генных видов микроорганизмов. Плазмиды с неизвестной функцией (крити­ческие) используются для маркирования. Плазмиды большого молекулярного

веса (шигелл, иерсиний, энтеропатогенных кишечных палочек) связаны с виру­лентностью. Их выявление важно для анализа изменчивости возбудителей.

Возникновение метода переноса колоний непосредственно с чашки на ни­тро- или диазобумагу позволяет осуществлять скрининг даже без выделения отдельных культур. Можно определять присутствие у составляющих колонию микроорганизмов гомологичных последователей ДНК при помощи молеку­лярных зондов (блот-гибридизация колоний) или способность их синтезиро­вать определенные продукты при помощи иммунологических зондов (имму­ноблоттинг колоний).

В настоящее время возможно внедрение в эпидемиологическую практику ДНК-зондов на присутствие генов токсигенности: Corynebacterium diphteriae, Vibrio cholerae, энтеротоксигенных Е. coli, скарлатинозных Streptococcus pyoge­nes. Имеются зонды для выявления генов адгезии Е. coli, инвазии возбудите­лей родов Escherichia, Yersinia, Shigella и т. д. Создана категория зондов, ос­нованная на генах рибосомной РНК, позволяющих идентифицировать виды, роды и более крупные таксономические группы микроорганизмов.

Методы углубленных молекулярно-генетических исследований также имеют высокую молекулярно-эпидемиологическую значимость. Они способ­ствуют выяснению молекулярных механизмов развития эпидемического про­цесса. Следует назвать анализ фрагментов нуклеиновых кислот, полученных ферментативным расщеплением (рестрикционный анализ ДНК бактерий, оли- гонуклеотидное картирование РНК-генома вирусов), и определение нуклео­тидной последовательности наиболее важных фрагментов генетического аппа­рата. В настоящее время метод секвенирования эффективно применяется для изучения изменчивости вирусов.

Большая роль молекулярно-эпидемиологических исследований все боль­ше раскрывается с течением времени. Они вносят решающий вклад в понима­ние внутренних механизмов развития эпидемического процесса.