Молекулярные механизмы нейродегенерации клеток сетчатки при ишемии

Г.Р. Каламкаров, А.Е. Бугрова,

Т.С. Константинова, Т.Ф. Шевченко

Уже в начале прошлого века один из первых лауреатов Нобелевской премии Рамон-и-Кахаль назвал сетчатку «мозгом, вынесенным на периферию».

Такое сходство приводит к тому, что и многие молекулярные механизмы, связанные с гибелью нейронов, имеют одинаковый патогенез. В ряде случаев даже при отсутствии клинических признаков заболевания мозга в сетчатке наблюдаются одинаковые молекулярные проявления. Так, при болезни Альцгеймера, причиной (не исключено что и следствием) которой является накопление Р-амилоида, Р-амилоид обнаруживается и в сетчатке глаза.

Другим примером является рассеянный склероз. При этом заболевании, которое характеризуется, в частности, и нарушениями функции зрительного нерва, клинические проявления неврита зрительного нерва часто являются первым эпизодом заболевания. Причиной этого является глубокая морфологическая и функциональная связь мозга и сетчатки, когда аксоны ганглиозных клеток сетчатки и формируют зрительный нерв.

Среди заболеваний, патогенез и молекулярные механизмы которых в мозге и сетчатке сходны, особое место занимает ишемия. Термин «ишемия» означает снижение кровоснабжения ткани. Для ишемии всегда характерно состояние гипоксии (недостаток кислорода) или аноксии (полное его отсутствие).

Сокращения: ВГД - внутриглазное давление; ВМД - возрастная макулярная дегенерация; ВЯС - внутренний ядерный слой; ГК - ганглиозные клетки; ДНК-Ж - динитрозильный комплекс железа с глутатионом; ДР - диабетическая ретинопатия; РН - ретинопатия недоношенных; СОД - супероксиддисмутаза; ЭРГ - электроретинограмма; ASICs - кислоточувствительные ионные каналы; NOS - NO-синтаза.

наблюдаться при снижении доступности кислорода или способности клеток его утилизировать, например, при снижении pO₂, снижении уровня гемоглобина, повреждении митохондриальных ферментов и т.д. При ишемии кроме недостаточного снабжения ткани кислородом наблюдается дефицит питательных веществ и накопление продуктов обмена. Ишемия всегда включает понятие гипоксии, однако при гипоксии далеко не всегда наблюдаются клинические признаки ишемии.

Целью настоящей работы явилась, с одной стороны, попытка проанализировать современные представления о молекулярных механизмах развития ишемии сетчатки и выявить их сходство с такими же процессами в мозге, с другой стороны - представить полученные нами данные о ключевой роли оксида азота как необходимого фактора в процессе развития ишемии в сетчатке.

Ретинальная ишемия сопровождает большинство офтальмологических заболеваний (Osbome et al., 2004; Stitt et al., 2011; Minhas et al., 2012). Ишемия сетчатки и зрительного нерва вовлечена в патогенез таких заболеваний, как окклюзии, или тромбоз ретинальных сосудов, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия (ДР), ретинопатия недоношенных (РН), глаукома (Bek, 2009). Однако, несмотря на многочисленные клинические и экспериментальные исследования, роль ретинальной ишемии в патогенезе этих заболеваний не до конца ясна. Ретинальная ишемия - клиническое состояние, при котором нарушается кровоснабжение сетчатки. Сетчатка является продолжением ЦНС и имеет много общих с мозгом эмбриологических, функциональных и анатомических признаков. Ответ на ишемию нейронов сетчатки сходен с ответом нейронов других частей ЦНС.

Среди молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза ишемии - окислительный стресс, эксайтотоксичность, аутоиммунные и воспалительные реакции. Эти механизмы часто выступают единым фронтом, в той или иной степени проявляясь при различных заболеваниях (Sharma, 2007). С другой стороны, при патологических состояниях, в развитии которых определяющую роль играет ретинальная ишемия, в спектре ее молекулярных механизмов всегда присутствуют действующие в тандеме другие ключевые механизмы ретинальных дегенераций. Например, ишемия может вызывать метаболическую дисфункцию нейронов сетчатки, стимулировать эксайтотоксичность, окислительный стресс, а индуктором окислительного стресса может выступать эксайтотоксичность.

Сетчатка особенно чувствительна к патологическим состояниям, которые нарушают сбалансированное взаимодействие ее нейрональной и сосудистой сети, обеспечивающей жизнедеятельность ретинальных нейронов. Поэтому заболевания, первично поражающие нейральную сетчатку (например дегенерация фоторецепторов), сопровождаются аномалиями сети ретинальных сосудов. С другой стороны, патологические состояния, клинически характеризуемые альтерацией хориоидальной или ретинальной сосудистой сети, такие как ВМД, ДР и РН, поражают также нейроны сетчатки, то есть всегда связаны с широким спектром гипоксических ишемических нарушений нейральной ткани (Zacchigna et a., 2007; Fulton et al., 2009).

Метаболическая дисфункция нейронов при ишемии приводит к необратимым повреждениям ткани и сопровождается гибелью клеток вследствие апоптоза (Osbome et al., 2004; Stitt et al., 2011; Fulton et al., 2009).

При рассмотрении молекулярных механизмов ишемических повреждений следует различать две стадии процесса - ишемию и реперфузию. Ишемия вызывается непосредственно понижением концентрации кислорода в клетках; реперфузия определяет ответ клеток на первичные ишемические изменения и возникновение компенсаторных механизмов.

К ишемии восприимчивы все нейроны сетчатки, однако наиболее чувствительными считаются ганглиозные клетки (ГК) (Kergoat et al., 2006; Chen et al., 2007; Kaur et al., 2008).

Фоторецепторы - специализированные клетки, имеющие самую высокую потребность в кислороде из всех клеток тела (Steinberg, 1987). Однако фоторецепторы менее чувствительны к ишемии, чем ГК, и для большинства ассоциированных с ишемией заболеваний наиболее характерным признаком поражения нейральной сетчатки является гибель ганглиозных клеток и истончение слоя нервных волокон. Интересно отметить, что именно уникальные для сетчатки, в отличие от мозга, структуры, а именно - фоторецепторы, наименее чувствительны к ишемическим повреждениям. Одна из причин подобных различий состоит в разной системе кровоснабжения наружных и внутренних клеточных слоев сетчатки. Кровоснабжение фоторецепторов осуществляется со стороны хориоидеи, и, поскольку фоторецепторные клетки характеризуются большой длиной, возникает градиент pO₂ между базальным и апикальным полюсами клеток. Высокая плотность митохондрий во внутреннем сегменте в норме поддерживает относительно низкое pO₂. Это свидетельствует о том, что фоторецепторы, вероятно, используют некие компенсаторные механизмы для выживания при низком содержании кислорода в окружающей их микросреде (Schmidt et al., 2003). На чувствительность фоторецепторов к ишемии влияет уровень световой адаптации. Светоадаптированные рецепторы менее чувствительны к ишемии и эксайтотоксичности. Палочки более чувствительны к ишемии, чем колбочки, возможно, поскольку колбочки обладают более высокой кальциевой буферной емкостью (Sharma, 2007). Амакриновые клетки во внутренней сетчатке также чувствительны к ишемии и эксайтотоксичности.

При ишемии блокируется снабжение сетчатки кислородом и глюкозой, что нарушает энергетический метаболизм, приводя к снижению внутриклеточного уровня АТФ. Это, в свою очередь, нарушает мембранный потенциал и ионный гомеостаз, запуская процессы, ведущие к гибели клеток. Одним из результатов снижения энергетического метаболизма является снижение активности Na⁺/K⁺ АТФ-азы, нарушающее регуляцию мембранного потенциала (Lipton, 1999).

Одним из проявлений снижения концентрации кислорода и соответствующих изменений энергообеспечения клетки при ишемии является ацидоз - закисление среды как вне клетки, так и внутри нее. Ацидоз играет важную роль в процессе ишемического повреждения ткани (Tombaugh, Sapolsky, 1993).

Молекулярные механизмы ацидоза идентифицированы, в основном, в экспериментах на мозге, однако предполагается, что эти механизмы являются общими для всех нервных тканей и, в частности, характерны для нейральной сетчатки. Закисление объясняется накоплением молочной кислоты, которое в условиях недостаточного снабжения кислородом вызвано переключением метаболизма с окислительного фосфорилирования на анаэробный гликолиз. Эффективность гликолитической генерации АТФ гораздо ниже аэробной, митохондриальной, поэтому процессы гидролиза АТФ начинают преобладать над синтезом этой молекулы, что способствует накоплению в клетке протонов. Интенсивный вывод протонов и лактата из клеток вызывает снижение pH вне клетки.

Обсуждаются разные механизмы, объясняющие повреждающий эффект ацидоза при ишемии. Было показано, что при ацидозе ингибируется депонирование внутриклеточного кальция, что приводит к повышению концентрации Са²⁺ в цитозоле (Siesjo et al., 1996). Повышение концентрации внутриклеточного кальция происходит в том числе и в результате активации кислото-чувствительных ионных каналов (ASICs). В норме в нервной ткани эти каналы, видимо, связаны с функционированием синапсов, вовлечены в процессы синаптической пластичности, обучения и памяти (Wemmie et al., 2002). Многочисленные эксперименты на нокаутных мышах и клеточных культурах с использованием блокаторов ASICs свидетельствуют о важной роли этих каналов в процессе ишемического повреждения нервной ткани (Chu, Xiong, 2012; Sherwood et al., 2011; Li et al., 2010). Еще одной причиной повреждения нейронов при ацидозе может быть усиление продукции свободных радикалов в клетке при низких значениях pH с вовлечением в этот процесс ионов железа (Musleh et al., 1994).

Большое количество экспериментальных данных свидетельствует о том, что избыток глутамата (явление эксайтотоксичности) приводит к гибели нервных клеток и является одним из основных проявлений ишемии (Louzada-Junior et al., 1992; Nu- cci et al., 2005; Russo et al., 2009). Эксайтотоксичность наблюдается при таких патологиях, как ДР, глаукома, окклюзия хориоидальных и ретинальных сосудов (Qu et al., 2010; Kowluru, Zhong, 2011; Li et al., 2012).

Гипотезу эксайтотоксической гибели нейронов впервые выдвинул Дж.В.Е. Ол- ней (Olney, Farber, 1994). Глутамат - основной возбуждающий нейротрансмиттер в сетчатке. Он высвобождается фоторецепторами, биполярными клетками и ГК (Sharma, Ehinger, 2003). В норме освобожденный глутамат находится в синаптической щели очень короткое время (несколько миллисекунд), и концентрация его низка, поскольку нейроны и глия эффективно удаляют нейромедиаторы из синаптической щели после их выделения. Если уровень глутамата остается повышенным достаточно долго, это может привести возбужденные нейроны к гибели. При физиологических условиях глутамат поглощается глиальными клетками, преобразуется глутаминсинтазой в глутамин, который затем транспортируется назад к телам нейронов и там при участии глутаминазы превращается в глутамат (Thoreson, Witkovsky, 1999). Снижение внутриклеточной концентрации АТФ в глиальных клетках при ишемии приводит к инактивации глутаминсинтазы, которая в таких условиях может дополнительно инактивироваться вследствие повышения уровня свободных радикалов (Oliver et al., 1990). Метаболический баланс глутамата изменяется, и в результате сильно увеличивается соотношение глутамат/глутамин в глиальных клетках, что также может способствовать ускоренному выходу глутамата. Основная нагрузка по удалению избытка глутамата во внутренних слоях сетчатки приходится на клетки Мюллеровой глии (Pow et al., 2000). При ретинальной ишемии эффективность захвата глутамата этими клетками снижается (Barnett et al., 2001). Дисфункция переносчиков глутамата в клетках глии зачастую является ключевым событием каскада реакций, ведущих к эксайтотоксической гибели нейронов сетчатки (Russo et al., 2013; Holcombe et al., 2008). Кроме того, снижению захвата глутамата клетками глии способствует ацидоз, развивающийся при ишемии (Billups, Attwell, 1996), и генерируемые в нейронах активные формы кислорода (Rao et al., 2003).

Основной причиной токсического действия глутамата является увеличение внутриклеточной концентрации кальция. Активация AMPA, каинатных и NMDA-рецепторов приводит к притоку Na⁺ в нейроны. Это, в свою очередь, усиливает деполяризацию, которая, среди других событий, активирует потенциал-зависимые Ca²+-каналы, увеличивая входной ток Ca²+ (Lipton, 1999; Sivakumar et al., 2013). В исследованиях на мозге было показано, что внеклеточная концентрация глутамата при ишемии повышается в два этапа: сначала наблюдается непродолжительное Ca^-зависимое повышение, за которым следует длительное Ca^-независимое повышение (Wahl et al., 1994). На ранней стадии ишемии высвобождение глутамата увеличивается за счет активации потенциал-зависимых Ca²+-каналов вследствие деполяризации мембраны, вызванной ишемией. Однако когда дефицит энергии достаточно длителен и внутриклеточный уровень АТФ становится слишком низким, чтобы обеспечивать высвобождение медиатора путем экзоцитоза, высвобождение глутамата становится Ca²+-независимым в результате активации альтернативных механизмов его высвобождения (Nishizawa, 2001).

Специфическая восприимчивость к глутамату нейронов внутренних слоев сетчатки и ганглиозных клеток при ишемии является следствием того, что эти клетки содержат ионотропные глутаматные рецепторы в высокой концентрации (Brandstatter et al., 1994). Глутамат активирует эти рецепторы, вызывая избыточную деполяризацию и, в конечном счете, гибель клетки. Напротив, вызывающие гиперполяризацию тормозные медиаторы типа ГАМК ослабляют влияние глутамата, противодействуя деполяризации (Schwartz-Bloom, Sah, 2001). Таким образом, повышение концентрации медиаторов, которые стимулируют тормозные рецепторы, защищает нейроны, содержащие эти рецепторы.

Глутамат также способствует образованию активных форм кислорода. На первых стадиях ишемии они возникают в результате нарушения кровоснабжения, а следовательно и снабжения кислородом и метаболическими субстратами. В дальнейшем, на стадии восстановления кровотока (реперфузии) и ожидаемого улучшения состояния ткани, патологический процесс продолжается вследствие так называемых реперфузионных повреждений, в которых участвуют свободные радикалы, образующиеся при повторном окислении накопленных при ишемии продуктов. Предполагают, что при значительном и достаточно быстром образовании свободных радикалов происходит подавление нормальных клеточных антиоксидантных защитных механизмов, вызывающее окислительный стресс и различные типы повреждения тканей (Gilgun Sherki et al., 2002).

Одним из участников повреждений при реперфузии является фермент ксанти- ноксидаза, который участвует в катаболизме пуринов, катализируя окисление гипоксантина в ксантин и его последующее окисление в мочевую кислоту. При этом в сопряженной реакции ксантиноксидаза восстанавливает кислород до супероксида, который спонтанно дисмутирует в пероксид водорода. Таким образом, в процессе этой реакции образуются активные формы кислорода, способные вызывать окислительный стресс. Так, при длительной ишемии в тканях накапливаются продукты распада пуринов, и при реперфузии, когда уровень кислорода восстанавливается, ксантиноксидаза продуцирует повышенное количество токсичных супероксида и пероксида водорода. В результате взаимодействия пероксида водорода и супероксида образуется очень токсичный гидроксильный радикал (О№). Кроме того, O₂^- может взаимодействовать с оксидом азота (NO), который образуется в значительных количествах после ишемии, приводя к формированию пероксинитрита, нитрозильного радикала и, в конечном счете, OH (Chan, 1996; Gilgun Sherki et al., 2002). По крайней мере, некоторые амакриновые клетки сетчатки являются дофа- минергическими (Sharma, Ehinger, 2003), и генерация активных форм кислорода во время окисления дофамина моноаминоксидазой в нервных окончаниях стимулирует развитие окислительного стресса.

Как известно, образование свободнорадикальных форм кислорода приводит к значительным повреждениям клеток нервной ткани в результате пероксидного окисления ненасыщенных жирных кислот клеточных мембран. При этом происходит как повреждение самих мембран (снижение их вязкости), так и образование вторичных пероксидных радикалов, которые могут индуцировать развитие ишемических и постишемических (при реперфузии) повреждений (Celebi et al., 2002).

Введение в глаз взрослой крысы NMDA вызывает дозозависимую потерю ГК и холинергических амакриновых клеток (Siliprandi et al., 1992; Osborne et al., 2004), подобную той, которая наблюдается при ишемии. С другой стороны, ишемическое повреждение сетчатки может быть обратимым при добавлении антагонистов NMDA и AMPA или каината (Osborne et al., 2004). До настоящего времени остается неясным, как взаимосвязаны процессы эксайтотоксичности и апоптотической гибели клеток при ишемии. Ишемия непосредственно запускает эксайтотоксическую нейродегенерацию, и апоптотическая нейродегенерация может развиваться как ее последствие, поскольку оставшиеся нейроны (выжившие после эксайтотоксичес- кой дегенерации) лишены синаптических контактов, необходимых для их выживания (Young et al., 2004).

Ранее полагали, что ишемическая гибель клеток происходит исключительно путем классического некроза, поскольку его морфологическим критерием является набухание клеток. Гибель клеток внутренних слоев сетчатки при окклюзии центральной артерии сетчатки происходит и по пути апоптоза, и по пути некроза (Gaydar et al., 2011; Das et al., 2008; Dratviman-Storobinsky et al., 2008). Ретинальная ишемия, созданная повышением внутриглазного давления (ВГД), приводила к апоптотической гибели клеток, что было продемонстрировано гистологически, по фрагментации ДНК и в экспериментах с использованием ингибитора эндонуклеазы (Lam et al., 1995).

Известно, что ишемия сетчатки приводит к экспрессии каспазы-3 (Zhang et al., 2005, 2007), Bax, Bcl-x (Zhang et al., 2005; Produit-Zengaffinen et al., 2009), NF-kB (Wang et al., 2006), разных изоформ NO-синтазы (Nucci et al., 2005; Sennlaub et al., 2002; Kaur et al., 2008; Kim et al., 2012), и это лишь небольшая часть белков, участвующих в индукции апоптоза. Инактивация этих белков может предотвращать клеточную гибель при ретинальной ишемии, как, например, это было показано в экспериментах с использованием специфических ингибиторов каспаз. Это позволяет надеяться, что создание фармакологических средств, предотвращающих развитие апоптоза, может предотвратить дегенерацию клеток сетчатки при заболеваниях глаза, обусловленных ишемией.

Что касается апоптотической гибели клеток с участием NO-синтазы (NOS), а следовательно и NO, то повышение экспрессии нейрональной и индуцибельной NO-синтазы (nNOS и iNOS, соответственно) при ретинальной ишемии продемонстрировано на различных экспериментальных моделях (Nucci et al., 2005; Sennlaub et al., 2002; Kaur et al., 2008; Kim et al., 2012). При ишемии повышается внутриклеточная концентрация кальция, что приводит к активации NOS и повышению концентрации NO (Osborne et al., 2004).

Предполагается, что нейротоксичность NO обусловлена образованием перокси- нитрита (ONOO^-) при взаимодействии NO с супероксид-анион-радикалом. In vitro скорость этой реакции в три раза выше, чем активность супероксиддисмутазы (СОД) (Ischiropoulos, Beckman, 2003; Beckman et al., 1990). Таким образом, при значительных концентрациях NO эффективно конкурирует с СОД за супероксид-анион.

Повышенное образование супероксидного анион-радикала при ишемии наблюдается на стадии реперфузии (Beckman, 1991). Химическое действие пероксинит- рита достаточно сложно. Он может проявлять активность и как гидроксильный радикал, и как радикал двуокиси азота. Пероксинитрит может нитровать и гид- роксилировать ароматические кольца аминокислотных остатков, а также окислять ДНК и сульфгидрильные группы белков (Ischiropoulos, Beckman, 2003), что может являться сигналом для апоптоза.

Для изучения молекулярных механизмов развития ишемии нервных тканей в сетчатке принципиальное значение имеет выбор соответствующей модели. Ишемия мозга в эксперименте достигается обычно путем кратковременной окклюзии сонной артерии, что позволяет изучать как механизм ишемии, так и механизм реперфузии. Существует несколько методик создания экспериментальной ишемии (Minhas et al., 2012), наиболее распространенными из которых являются искусственное повышение внутриглазного давления (Buchi et al., 1994) или наложение лигатуры на сосуды в области зрительного нерва (Otori et al., 1997). Каждый из этих подходов имеет свои недостатки. Метод повышения внутриглазного давления очень чувствителен к любым механическим воздействиям, что делает результаты нестабильными. Кроме того, повышение ВГД неизбежно ведет к дегенерации ганглиозных клеток, которая может и не быть обусловлена ишемией. Во втором случае при наложении лигатуры неизбежно повреждаются не только сосуды, но и зрительный нерв, что приводит к независимым от ишемии дополнительным патологическим изменениям в сетчатке. Таким образом, имеющиеся модели не могут дифференцировать гибель клеток сетчатки, вызванную ишемией, от гибели клеток, обусловленной независимой от ишемии дегенерацией клеток сетчатки. Понимание отличий этих механизмов патогенеза принципиально важно как для поиска перспективных лекарственных средств, так и для выбора правильной стратегии лечения. Так, антиишемические средства могут и не предотвращать гибель нейронов, вызванную другими причинами.

Избежать упомянутых недостатков при моделировании ишемии можно путем непосредственного локального воздействия лазерного излучения на магистральные ретинальные сосуды, что вполне выполнимо, поскольку они хорошо видны и доступны для лазерной коагуляции. Эта модель является удобной, так как позволяет избежать, с одной стороны, указанных выше недостатков, а с другой - получать избирательное тромбирование сосудов, создаваемое лазерной коагуляцией. Это позволяет, выбирая различные отделы магистральных ретинальных сосудов или их ветвей и изменяя параметры лазерного излучения, создавать как локальную, так и обширную ишемию сетчатки. Предлагаемая нами модель с использованием лазерной коагуляции имеет ряд преимуществ. Во-первых, изменение скорости кровотока происходит не в результате длительного (1-2 часа) воздействия, а в доли секунды (время экспозиции лазерного излучения). Это позволяет изучать ишемические нарушения в остром периоде. Во-вторых, модель быстро и легко реализуема при наличии лазерного оборудования и, в-третьих, лазерная коагуляция моделирует такое офтальмологическое заболевание, как тромбоз ретинальных сосудов. На описанной выше модели нами продемонстрировано также защитное действие оксида азота от ишемических повреждений клеток сетчатки. При этом важными являются два аспекта. Во-первых, ретинальные сосуды хорошо видны в офтальмоскопе: действие сосудорасширяющих факторов можно наблюдать в данном случае в реальном времени. По существу, такой подход позволяет визуально наблюдать за реакцией сосуда на гипоксию in vivo. Поскольку мы предполагали, что нитриты будут восстанавливаться в сосуде при гипоксии, это должно было приводить к резкому расширению сосуда. Во-вторых, коагуляция сосуда вызывает ишемию сетчатки и, если нитриты действительно восстанавливаются в сосуде при гипоксии, это должно было косвенно проявиться как защитный эффект при развитии ишемии сетчатки. Наиболее удобной для этих исследований оказалась модель ишемии на кроликах. Ретинальные сосуды кролика хорошо видны, что позволяет легко наблюдать их реакцию на лазерное воздействие. Кроме того, моделирование ишемии на кроликах позволит в перспективе использовать метод OCT (ocular computer tomography) для оценки тонких изменений сетчатки при ишемии, а также реконструировать трехмерное изображение ретинальных сосудов и точно измерять их диаметр.

Лазерная коагуляция ретинальных сосудов приводит к значительным изменениям в кровенаполнении сосудов. Если в норме сосуды сетчатки в области диска зрительного нерва не извиты и соответствуют средней норме, то сразу после лазерного воздействия видно, что сосуды запустели и резко уменьшились в диаметре (рис. 1а,б).

Рис. 1. Действие нитрита натрия на сосуды глазного дна после лазерной коагуляции а - фотография глазного дна кролика до лазерной коагуляции (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б - то же, сразу после лазерной коагуляции, в - то же, что «б», через 15 минут после введения нитрита натрия

Для выяснения возможного действия нитритов на сетчатку глаза и ретинальные сосуды нитрит натрия вводили животным как до, так и после проведения лазерной коагуляции. В том случае, когда нитрит натрия вводили кролику в течение 15 минут после лазерной коагуляции в количестве 20 мг/кг массы, наблюдалось восстановление кровенаполнения сосудов непосредственно за зоной лазерного воздействия (рис. 1в). В самих поврежденных сосудах начинается восстановление кровообращения. Таким образом, введение нитрита натрия на фоне гипоксии приводит к быстрому расслаблению сосудов, что свидетельствует о том, что в условиях ишемии нитрит быстро восстанавливается до оксида азота. При предварительном введении нитритов картина была другой. Животному сначала вводили нитрит натрия (20 мг/ кг), а затем, через 15 минут, производили лазерную коагуляцию и наблюдали за изменением сосудов глазного дна (рис. 2). В этом случае лазерное воздействие создавало не стойкий, а лишь кратковременный спазм сосуда с быстрым последующим восстановлением кровенаполнения и проводимости сосуда.

Рис. 2. Введение нитрита натрия предотвращает развитие ишемии сетчатки при лазерной коагуляции сосудов

а - фотография глазного дна кролика после введения нитрита до лазерной ишемии (стрелка указывает место последующего лазерного воздействия); б - то же, сразу после лазерного воздействия на фоне предварительного введения препарата

Таким образом, можно заключить, что нитрит натрия в условиях острой гипоксии приводит к почти мгновенному расширению сосудов, что и делает лазерную коагуляцию неэффективной. Можно предполагать, что в условиях гипоксии, когда нитриты могут связываться с гемом гемсодержащих белков, может происходить их восстановление до оксида азота в концентрациях, достаточных для быстрого и полного расслабления сосудов.

Известно, что ишемия сетчатки сопровождается характерными изменениями в картине фотоэлектрической активности сетчатки - электроретинограмме (ЭРГ). Использование ЭРГ позволило оценить действие нитритов на ретинальные сосуды по изменению электрической реакции сетчатки глаза, то есть независимым методом. Регистрация ЭРГ выполнялась сразу после лазерной коагуляции, после введения препарата на фоне лазерного воздействия и после лазерного воздействия на фоне предварительного введения нитрита натрия. Лазерная коагуляция сосудов сетчатки приводила к резкому снижению амплитуд а- и b-волн ЭРГ (рис. 3). Введение нитрита натрия в дозе 20 мг/кг массы через 15 минут после лазерной коагуляции приводило к более быстрому восстановлению а- и b-волн ЭРГ. Наибольший положительный эффект препарата был выявлен при его введении до создания лазерной ишемии сетчатки, где не наблюдалось угнетения биопотенциалов.

Глиальный индекс K_p рассчитываемый по отношению амплитуд b-волны ЭРГ и РЭРГ (12 Гц), равнялся 1,8 при норме 2,3-2,5 относительных единиц. Известно, что возрастание глиального индекса, отражающее активизацию метаболизма клеток Мюллера, является характерным признаком ретинальной ишемии. Однако при острых нарушениях кровообращения в бассейне центральной артерии сетчатки b-волна ЭРГ быстрее реагирует на гипоксию сетчатки, связанную с сосудистой катастрофой, чем низкочастотная РЭРГ. Поэтому опережающее снижение амплитуды

Рис. 3. Динамика изменения амплитуд волн ЭРГ при действии нитритов

а - амплитуда a-волны ЭРГ, б - амплитуда b-волны ЭРГ. Черный цвет - амплитуды а- и b-волн ЭРГ до проведения операции. Белый - то же, через 15 мин после проведения лазерной коагуляции. Штриховка - амплитуды а- и b-волн в том случае, когда через 15 мин после проведения лазерной коагуляции животному вводился нитрит натрия. Серый - амплитуда волны в том случае, когда лазерная коагуляция проводилась через 15 мин после введения нитрита натрия, р