Выявление возбудителей острых респираторных вирусных инфекций с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции

Для одномоментного определения респираторных вирусов в мазках из ротоглотки методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации использовали набор реагентов «АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), который обеспечивает выявление специфических фрагментов нуклеиновых кислот следующих возбудителей ОРВИ: РНК человеческого респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 1 -4 типов, человеческих коронавирусов, человеческого метапневмовируса, человческих риновирусов, а также ДНК человеческих аденовирусов групп B, C, E и бокавирусов.

Материалом для проведения исследования являлись пробы кДНК (комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота), выделенные из ротоглоточных мазков. Мазки брали с помощью сухих стерильных зондов с ватными тампонами с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки, после полоскания ротовой полости водой. Затем рабочую часть зонда с ватным тампоном помещали в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой. Использовали транспортную среду для хранения и транспортировки респираторных мазков (ТУ 9398-083-01897593-2009) - реагент для хранения мазков из полости носа и ротоглотки (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии

Роспотребнадзора, Россия). Конец зонда отламывали так, чтобы имелась возможность плотно закрыть крышку пробирки. Если мазки одновременно брались из полости носа и ротоглотки, то их совмещали в одной пробирке.

Исследование состояло из следующих этапов: экстракция ДНК/РНК из исследуемых образцов, реакция обратной транскрипции, амплификация с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ и интерпретация полученных результатов. Для выделения генетического материала исследуемых вирусов использовали комплект реагентов и автоматическую станцию «NucliSENS easyMAG» (bioMerieux, Франция), для проведения реакции обратной транскрипции - комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» с реагентом RT-G-mix-1 (ТУ 9398-005-01897593-2008) - вариант 100 (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и программируемый амплификатор роторного типа Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия). Анализ результатов проводили с помощью программного обеспечения входящего в комплект поставки прибора Rotor-Gene Q.

ДНК/РНК возбудителя обнаруживались, если в таблице результатов по соответствующему каналу было определено значение порогового цикла для данной пробы. Причем кривая флуоресценции должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции. ДНК/РНК возбудителя не обнаруживалась, если в таблице результатов по соответствующему каналу отсутствует значение Ct для этой пробы (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), и в таблице результатов по каналу для флюорофора FAM (карбоксифлуоресцеин) значение порогового цикла Ct определено и не превышает пограничное значение. Анализ считается

невалидным, если для данной пробы отсутствует значение Ct по соответствующему каналу детекции, а по каналу FAM/Green значение С также отсутствует или превышает указанное пограничное значение. В этом случае исследование проводят повторно с этапа экстракции ДНК/РНК.

Результаты исследования считали достоверными, если были получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК/РНК в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций. Аналитическая чувствительность метода для РСВ, метапневмовирусов, вирусов парагриппа, риновирусов и бокавирусов составляет 1 * 10³ ГЭ/мл (геном-

эквивалент/миллилитр), для коронавирусов 1 * 10⁴, аденовирусов 5 * 10³.

2.3