7.1. Экспериментальная работа по пересадке аллогенных керотинацитов на искусственно созданные рубцы белых крыс.

Желание использовать клеточный потенциал и необходимость поиска новых эффективных методов улучшеня эстетического вида рубцов привели к идее попытаться изучить возможность пересадки кератиноцитов на рубцовые поверхности

Для того, чтобы доказать вероятность использования культуры кератиноцитов для улучшения вида рубцов была проделана экспериментальная работа на белых лабораторных крысах, которым создавались рубцовые поверхности.

Выделение и выращивание крысиных эпидермоцитов осуществлялось в лаборатории клеточных технологий Института Цитологии РАН последующей технологии.

Кожу промывали в солевом растворе Хенкса, содержащем 200 U/ml гентамицина, разрезали на мелкие кусочки, площадью 0,2-0,5 см². Кусочки кожи инкубировали в 0,5% растворе диспазы в сбалансированном солевом фосфатно­буферном растворе при температуре 37°С в течение часа. Затем кусочки переносили в фосфатный солевой буферный раствор Дульбекко и отделяли эпидермис от дермы. Эпидермис инкубировали в 0,125% растворе трипсина в течение 10-15 минут при перемешивании со скоростью 50 об/мин, после чего действие фермента останавливали добавлением 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Одну треть полученной суспензии клеток использовали в чистом виде для одного из вариантов пересадки на рубцы, вторую треть выращивали на биосовместимых отечественных пленочных покрытиях «Полипор», третью - на чашках Петри без подложки. Операция дермабразии полученных рубцов у крыс с последующей пересадкой на них крысиных эпидермоцитов осуществлялась под эфирным наркозом с помощью термокаутера.

Первой группе крыс после дермабразии на отшлифованную, промытую физиологическим раствором и высушенную поверхность рубца накладывались стерильные кусочки батиста, на которые наносилась взболтанная суспензия аллогенных крысиных эпидермоцитов в концентрации 1,5 миллиона клеток в 1 мл (по данным института Цитологии). Батистовые кусочки укладывались на отшлифованный рубец так, чтобы клетки легли на поверхность рубца. Сверху накладывалась повязка из нескольких слоев марли, которая пришивалась к краям рубца.

Часть полученной взвеси клеток высевали в чашки Петри на стерильные пленки «Полипор», вырезанные по форме чашек, другая часть - на чашки Петри без пленки. Культивирование осуществляли в среде FAD, состоящей из смеси среды DMEM и F12 в соотношении 3:1. с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5 мкг/мл инсулина (Sigma), 0,5мкг/мл гидрокортизона гемисукцината (Sigma), 10 мкг/мл эпидермального фактора роста ЭФР (Институт Цитологии РАН, СПб). Вторая и третья группы крыс по 7 особей были прооперированны через 6 дней после первой. К этому времени в чашках Петри из суспензии высеенных кератиноцитов образовывались многослойные пласты, которые и пересаживались крысам. Второй группе пересаживались эпидермоциты на пленке, третьей - многослойным пластом без подложки. Через 7 дней, полученные многослойные пласты аллогичных кератиноцитов (МПАлК), высеянные на пленках «Полипор» пересаживались культурой непосредственно на раневую поверхность. Сверху пленка, во избежание ее сдирания фиксировалась многослойной марлевой повязкой и пришивалась к коже крыс.

Перед пересадкой кератиноцитов третьей группе крыс, выращенных без подложки, производилось отделение ПАК от дна чашки Петри обработкой диспазой, обладающей способностью избирательно нарушать дермо­эпидермальные связи. При действии на многослойный пласт диспаза разрушает связь клеток базального слоя с дном чашки Петри и в значительно меньшей степени влияет на межклеточные связи, что дает возможность «снимать» пласт целиком.

На пленки «Полипор» и салфетки «Лита-цвет» накладывались многослойные марлевые повязки, которые пришивались к коже крыс для более прочной их фиксации. Каждая крыса отсаживалась в отдельную клетку, для создания оптимальных условий ее содержания и приживления пересаженных кератиноцитов. Повязки крыс, которым пересаживалась суспензия и многослойный пласт эпидермоцитов, снятый диспазой, ежедневно по несколько раз в день увлажнялись стерильным физиологическим раствором, для создания клеткам наиболее благоприятных условий для приживления. Учитывая, что пленка «Полипор» была непроницаема для воды, крысам второй группы увлажнение повязок не производилось, что было одним из преимуществ перед пересадками без пленок.

Взятие биопсийного материала у крыс.

Через 1, 2, 5 и 9 месяцев после пересадки крысиных аллогичных кератиноцитов на шлифованные рубцы белых крыс, производилось взятие материала для гистологического, цитоморфологического и электрон­номикроскопического исследования. В качестве контроля были взяты образцы нормальной крысиной кожи и рубца без трансплантации клеток. Анестезия крысам осуществлялась с помощью эфирного наркоза.

После анестезии из отмеченных участков, на которые пересаживались кератиноциты, биопсийным пробойником диаметром 2 мм. брались кусочки рубцовой ткани и помещались в 2,5% раствор глютарового альдегида для подготовки материала к электронномикроскопическому исследованию. Кусочки тканей, взятые для гистологического исследования, помещались в 10% раствор нейтрального формалина с последующей проводкой через спирты и заливкой в парафин, с последующей нарезкой ультратонких срезов и просмотром их в светооптическом микроскопах.

Контроль 1. Нормальная кожа крысы.

Для того чтобы увидеть разницу между микроскопической картиной нормальной рубцовоизмененной кожи крыс и рубцов через определенные сроки после пересадки МПК, демонстрируются фотографии и описания к ним на всех этапах данного исследования.

Эпидермис нормальной кожи состоит из 7-9 слоев клеток. Роговой слой умеренной толщины. Местами состоит из 6-8 слоев роговых чешуек (Фото 29а). Базальный слой представлен клетками циллиндрической формы с крупными светлыми, правильной формы ядрами и несколькими ядрышками. Четко выражены десмосомальные связи между клетками и с базальной мембраной. Под хорошо выраженной базальной мембраной, которая имеет мелкие выросты в субэпидермальный слой, параллельно ей лежат нежные пучки коллагеновых и эластиновых волокон, среди которых удлиненной формы фибробласты, мелкие сосуды (Фото 296).

Контроль 2. Рубец крысы 2-х месячной давности.

Клиническая картина. Рубцы бледно-розовые, с шелушением, местами сохраняются корочки. Их площадь уменьшилась за счет контракции коллагеновых волокон и стала приблизительно 3,0-3,5 см². Придатки кожи отсутствуют.

Микроскопическая картина. Эпидермис состоит из 3-5 слоев клеток.

складчатый, представлен базальными клетками округлой формы, одним рядом шиповидных, 1-2 рядами зернистых с зернами кератогиалина в верхнем слое, имеются участки внутриклеточного отека. Роговой слой неоднородно изменен от очень тонкого до утолщенного. Отмечается складчатость рубца за счет (контракции) рубцовой ткани. Складки проникают до сосочкового слоя и создают впечатление сосочков (Фото 30). Граница между эпидермисом и дермой представляет собой прямую линию. Базальная мембрана не везде прослеживается. В нижней части субэпидермального и более глубоких слоев - сосуды с толстой, разрыхленной стенкой, много запустевших, с явлениями стаза. Вокруг сосудов - скопление макрофагов, фибробластов. Макрофаги обступают вышедшие из капилляров эритроциты и фагоцитируют их. В более поверхностных слоях - мелкие капилляры. Под эпидермисом коллагеновые волокна рыхло расположены. В более глубоком слое рубца-грубые пучки коллагеновых волокон среди которых много фибробластов.

Рубец крысы через месяц после пересадки МПЛл крысиных кератино­цитов.

Клиническая картина. Рубцы розовые, их площадь уменьшилась, особенно в поперечнике и составляет в среднем 2,5-3 см². Волосы и сальные железы отсутствуют.

Данные микроскопического исследования материала, полученного от крыс с пересадкой МПАлК на пленке и МПАлК без подложки, практически одинаковы. Однако чисто технически работа с МПАлК без подложки на много сложнее и кропотливее, чем при выращивании МПАлК на подложке, поэтому при дальнейшем изучении вопроса пересадки кертаиноцитов на рубцы мы использовали в качестве основы для выращивания («подложек») многослойный батист.

Микроскопическая картина. Отмечается утолщение эпидермиса до 15- 20 слоев, практически до середины которого кератиноциты имеют узкую, удлиненную, вертикальную форму и компактное расположение (Фото 31). Базальные клетки располагаются неровной линией. Их ядра светлые, крупные, округлой формы с одним или двумя ядрышками, что говорит о их высокой синтетической и пролиферативной активности. Граница между эпидермисом и дермой представляет собой прямую линию. Шиповатый слой хорошо развит, состоит из 3-5 слоев клеток округлой формы, имеются 2- х ядрышковые клетки.

Сразу под базальной мембраной - плотнорасположенные тонкие пучки коллагеновых волокон, параллельно им большое количество запустевших сосудов, глубже коллагеновые волокна более грубые, собранные в плотные пучки. Много крупных фибробластов, тучных клеток (2-3 в поле зрения), макрофагов лейкоцитов и запустевших сосудов, стенки которых разрыхлены, вокруг них - рыхло расположенные коллагеновые волокна (Фото 31 б). В некоторых сосудах - стаз, диапедез форменных элементов. Вокруг сосудов - фибробласты, единичные лимфоциты. Придатки кожи отсутствуют.

При пересадке на шлифованный рубец суспензии кератиноцитов микроскопическая картина отличается от предыдущей. У большинства животных - эпидермис тонкий, состоит из 5-6 слоев клеток. Нижний слой состоит из клеток неправильной, полигональной формы с ядрами округло-неправильной формы. Состояние субэпидермального слоя аналогично его состоянию в группе животных без пересадки МПАлК.

В данном случае можно говорить либо о запаздывании процессов, сопутствующих трансплантации клеток, либо о большой потере клеток, пересаженных в виде суспензии. Отсюда был сделан вывод о нецелесообразности коррекции рубцов пересадкой кератиноцитов в виде суспензии.

Рубец крысы через 2 месяца после пересадки МПАл крысиных кератиноцитов.

Клиническая картина. Рубец выглядит тонким, нежным. Местами отмечается шелушение, чешуйки.

Микроскопическая картина, Роговой слой утолщен, местами - гиперкератоз. Эпидермис утолщен, состоит из 12-20 рядов клеток. Граница между эпидермисом и дермой представляет собой прямую линию. Нежные коллагеновые волокна под эпидермисом лежат достаточно плотно. В более глубоких слоях рубца они собраны в грубые большие пучки. В суб­эпидермальном слое появляется новообразование сосудов. В более нижних слоях рубцовой ткани - много запустевших сосудов, располагающихся параллельно поверхности эпидермиса. Крупные фибробласты равномерно распределены в толще рубца, имеются гигантские, многоотростчатые, много макрофагов.

Рубец крысы через 5 месяцев после пересадки МП крысиных эпидермоцитов.

Клиническая картина. Рубец выглядит ровным, гладким без шелушения, имеются единичные волосы, их густота больше на периферии рубцов, что говорит о краевом врастании волосяных фолликулов в рубец и новообразование волосяных фолликулов. Площадь рубцов продолжает уменьшаться.

Микроскопическая картина. Эпидермис по-прежнему толстый (15-20 слоев, местами до 30) в верхних слоях заполнен зернами кератогиалина. Четко видна базальная мембрана. Под ней коллагеновые волокна лежат рыхло. В нижних слоях - коллаген более мощный и плотно упакован. Среди пучков коллагена много капилляров (Фото 32а). В верхних слоях уменьшилось количество запустевших сосудов. Соединение эпидермиса и дермы слегка волнообразное. Местами имеются глубокие эпидермальные выросты в рубцовую ткань. Среди коллагеновых волокон видны новообразованные сосуды (Фото 326). Появляются единичные волосяные фолликулы и сальные железы.

Рубец крысы через 9 месяцев после пересадки МПЛ.і крысиных эпидермоцитов.

Клиническая картина. Рубцы стали значительно меньших размеров по сравнению с более ранними сроками, их площадь в среднем составляет около 1,5-2,0 см². Рубцы неравномерно покрыты тонкими волосами, особенно по периферии. Сохраняется незначительное мелкопластинчатое шелушение.

Микроскопическая картина.

Эпидермис стал тоньше, представлен из 6-8 рядов клеток, напоминает по строению эпидермис нормальной кожи крыс, только плотность клеток на 1 мм. выше и они мельче (Рис.ЗЗа). Базальный слой состоит из мелких клеток округло- цилиндрической формы. Базальная мембрана хорошо выражена, четко видны полудесмосомы. Отмечается наличие эпидермальных выростов в субэпидермальный слой. Сосочковый слой выражен по всей длине рубца. Данные факты говорят о том, что этому периоду времени сцепление пересаженных кератиноцитов стало значительно более прочным с нижележащими тканями рубца. Следовательно, уход за рубцами людей с пересадкой МПАлК через 9 месяцев после пересадки МПК может быть традиционным. Под эпидермисом более нежные коллагеновые волокна, чем в глубоких слоях. Появилось много сосудов, особенно поверхностно расположенных. В более крупных сосудах стенки утолщены. Волосяные фолликулы и сальные железы в большом количестве. Микроскопическая картина напоминает дермоподобную ткань.

7.1.1.