Ферменты метилирования

Метилирование остатка цитозина представляет собой перенос метильной группы с молекулы донора на пятый атом углерода в молекуле цитозина ферментативным путем. В клетке наблюдаются два независимых процесса метилирования, осуществляемых, по-видимому, разными ДНК-метилтрансферазами.

У млекопитающих наиболее изученным является фермент ДНК(цитозин-5)-метилтрансфераза 1 (Dnmt1), которая в соматических клетках млекопитающих является основным ферментом, имеющим метилтрансферазную активность (Yoder et al. 1997). C-концевой домен Dnmt1 имеет такую же структуру, что и осуществляющие метилирование цитозина ферменты бактерий, которые содержат 10 консервативных мотивов, образующих каталитический центр (Bestor et al. 1988). N-концевой домен представляет собой регуляторную область. Он содержит сигнал ядерной локализации - последовательность, направляющую фермент в локус репликации ДНК (Liu et al. 1998), и район взаимодействия с белком репликации PCNA (Chuang et al. 1997) и фактором регуляции клеточного цикла Rb (Pradhan and Kim 2002). Необходимость Dnmt1 для развития млекопитающих продемонстрирована на мышах. Их эмбриональные стволовые клетки с гомозиготной инактивацией Dnmt1 нормально размножаются, имея сильно деметилированный геном, но погибают при индукции дифференцировки in vitro. Мышиные эмбрионы, несущие дефектную Dnmt1, умирают при имплантации (Li et al. 1992). Показано, что Dnmt1 имеет in vitro высокое сродство к полуметилированной ДНК, как к субстрату для метилирования CpG динуклеотидов.

В настоящее время у млекопитающих известно еще три гена, кодирующие белки, аминокислотная последовательность которых также содержит метилтрансферазный домен. Они были обозначены как Dnmt2 (Yoder and Bestor 1998), Dnmt3a и Dnmt3b (Okano et al. 1998). Белок Dnmt2 содержит 6 из 10 консервативных метилтрансферазных мотивов, но лишен большого N-концевого домена. Его мРНК присутствует в малых количествах во всех типах клеток, но, несмотря на наличие метилтрансферазного домена, выявить у Dnmt2 какой-нибудь метилтрансферазной активности на настоящий момент не удалось (Yoder and Bestor 1998).

Dnmt3a и Dnmt3b экспрессируются в больших количествах в эмбриональных стволовых клетках, но в тканях взрослого организма их экспрессия подавлена. Их С-концевой домен аналогичен цитозин­метилирующим ферментам, тогда как последовательность N-концевого отличается от аналогичного домена Dnmt1. Было показано, что обе эти метилтрансферазы обладают одинаковой способностью метилировать полуметилированную и неметилированную ДНК (Okano et al. 1998). Мутация в каталитических центрах Dnmt3a и Dnmt3b лишает эти ферменты способности к de novo метилированию in vivo (см. обзор Hsieh 1999). Инактивация Dnmt3a и Dnmt3b в эмбриональных стволовых клетках показала их необходимость для нормального эмбрионального развития млекопитающих (Okano et al. 1999). В той же работе было продемонстрировано, что эти метилтрансферазы имеют как общие сайты метилирования, так и строго специфичные. Так, Dnmt3b участвует в метилировании минисателлитных повторов центромеры, тогда как Dnmt3a нет.

Исследование уровня мРНК трех человеческих метилтрансфераз DNMT1, DNMT3a и DNMT3b показало, что они проявляют координированный характер экспрессии, как в эмбриональных клетках, так и в тканях взрослого организма (Robertson et al. 1999). По всей видимости, в процессе метилирования ДНК de novo участвуют все три метилтрансферазы, специфически распределяя роли в установлении паттерна метилирования генома. Для установления импринтинга в женских половых клетках показана также необходимость присутствия белка DNMT3L, который не имеет метилтрансферазной активности и колокализуется вместе с DNMT3a и DNMT3b, в то время как за поддержание этого импринтинга ответственна ооцит-специфическая изоформа DNMTlo (Jaenisch and Bird 2003).