Анализ метилирования гена RUNX3.
Метилирование CpG-островка промоторных областей гена RUNX3 определяли при помощи метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР). Метод МС-ПЦР основан на модификации геномной ДНК бисульфитом натрия.
В ходе такой обработки происходит химическое превращение неметилированных остатков цитозина в урацил, тогда как 5-метилцитозин остается в неизменном виде. По изменению нуклеотидного состава в результате обработки бисульфитом натрия можно судить о состоянии метилирования каждого цитозинового остатка на исследуемом фрагменте ДНК. Использование специфических праймеров позволяет разделить метилированную и неметилированную формы исследуемой ДНК.Геномную ДНК денатурируют с помощью NaOH (конечная концентрации 0,3 М) с последующей инкубацией при 650С в течении 15 минут и проводят бисульфитную модификацию при помощи бисульфита натрия (конечная концентрация 2 М) и гидрохинона (конечная концентрация 0,5 М) в течение 15 часов при 60°С. Очистку ДНК-бисульфитной смеси проводят с помощью 750мкл буфера для очистки (гуанидин гидрохлорид 7М, силикагель 17,5мг/мл). Тщательно перемешивают и центрифугируют 4 мин при 13000 об/мин. Полученный осадок промывают изопропанолом (1мл) и высушивают. К сухому осадку добавляют 50мкл деионизованной воды, ресуспензируют, и используют для проведения реакции МС-ПЦР.
МС-ПЦР проводится при помощи специфических праймеров на метилированную (metRUNX3 F:ataatagcggtcgttagggcgtcg, metRUNX3
R:gcttctactttcccgcttctcgcg) и не метилированную (unmetRUNX3
F:ataatagtggttgttagggtgttg, unmetRUNX3 R;acttctactttcccacttctcaca). Фрагменты, полученные в результате ПЦР, разделяют посредством вертикального электрофо-
реза в ПААГ. Результаты ПЦР оцениваются при окраске геля нитратом серебра, с последующим фотографированием или сканированием.
пациент №4 пациент №5 пациент №6 пациент №7 пациент№8 umumu mumum
m- метилированная форма ДНК, u - не метилированная форма ДНК.
Рисунок 5: Определение метилирования гена RUNX3 в биоптатах культи жедудка пациентов методом МС-ПЦР.
ПААГ после электрофореза с результатами МС-ПЦР и окраски нитратом серебра. В дорожках пациента №5 имеется метилированная и неметилированная форма ДНК. Это значит, что в материале пациента №5 ген RUNX3 аномально метилирован. У остальных пациентов №4,6,7,8 имеется только неметилированная форма, что позволяет исключить метилирование гена у этих пациентов.
2.5
Еще по теме Анализ метилирования гена RUNX3.:
- ОГЛАВЛЕНИЕ
- ВВЕДЕНИЕ
- Тканевой материал.
- Анализ метилирования гена RUNX3.
- Глава 4: Исследование молекулярно-генетических маркеров в неизмененной слизистой культи желудка у больных, оперированных по поводу рака в объеме резекции.
- Выводы: