РаспространЕнность мутаций, связанных с наследственными формами рака молочной железы, среди жителей г. Новосибирска

М.С. Анисименко

Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск

Целью настоящей работы явилось определение частот встречаемости некоторых онкологически значимых мутаций в популяции г.

Итак, какие мутации анализировали? Условно мы выделили 2 группы.

В первую вошли мутации, ассоциацию которых с возникновением РМЖ можно считать подтвержденной. Это 4 мутации в гене BRCA1 (5382insC, T300G, 185delAG и 4153delA) и мутация в гене CHEK2 – 1100delC.

Отметим также, что, согласно данным ряда исследований (например, Weischer M. et al., 2008), носители мутаций в генах BRCA1 и CHEK2 имеют высокий кумулятивный риск РМЖ.

В следующую группу для изучения мы включили мутации генов, кодирующих белки, связывающиеся с белком гена BRCA1 и, соответственно, также участвующие в процессе репарации ДНК, – 3 мутации в гене BARD1 (G1743C, T2006C, G2355A) и 1 мутация в гене BRIP1 – C2392T. Эти мутации начали изучать сравнительно недавно, и, по результатам некоторых работ, их наличие может способствовать развитию РМЖ.

Материалом для анализа послужила выборка ДНК жителей г. Новосибирска, состоящая из 7920 образцов. Для выполнения анализа решено было объединить аликвоты образцов ДНК в пулы. Под термином «пулирование» подразумевается простое смешение образцов ДНК. Полученная в результате смесь называется пулом.

В состав каждого пула входило по 20 индивидуальных образцов ДНК. Таким образом, из 7920 образцов было сформировано 396 пулов. Далее подготовленные пулы анализировали на присутствие ДНК, содержащих мутацию. Если в одном или нескольких пулах обнаруживалась мутация, далее проводился анализ индивидуальных образцов, входящих в состав данного пула. Для выявления мутаций использовали аллель-специфическую ПЦР[1] с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени. Далее проводится ПЦР с одной и с другой парой праймеров.

По прохождению или отсутствию амплификации судят о генотипе исследуемого образца. Так, если амплификация наблюдается с парой, включающей праймер Wt, и не наблюдается с парой, содержащей праймер Mut, образец является гомозиготой «дикого» типа. Если амплификация проходит в обоих случаях, образец – гетерозигота. И, наконец, если амплификация проходит только в случае использования праймера Mut, образец – мутантная гомозигота. Для возможности детекции амплификации в режиме реального времени была использована следующая технология.

К аллель-специфичным праймерам с 5’-конца в процессе синтеза добавляется уникальная нуклеотидная последовательность, содержащая флуоресцентый краситель. Также синтезируется нуклеотидная последовательность, комплементарная добавленной к аллель-специфичному праймеру и содержащая на 3’-конце темновой гаситель флуоресценции, так называемый «антипраймер».

При нахождении в реакционной смеси антипраймер образует дуплекс с 5’-концевой областью аллель-специфичного праймера, и кванты света, испускаемые флуорофором после возбуждения, поглощаются темновым гасителем.

В ходе первого цикла ПЦР происходит отжиг аллель-специфичного праймера на ДНК-матрицу и синтез комплементарной цепи, в результате чего флуорофор оказывается встроенным в ампликон.

На втором и последующих циклах ПЦР синтезированный ампликон выполняет роль матрицы, с которой гибридизуется общий праймер и синтезируется комплементарная цепь. В ходе синтеза комплементарной цепи происходит пространственное разобщение флуорофора и гасителя, и в результате генерируется флуоресцентный сигнал, детектируемый прибором.

В качестве подтверждения/опровержения ассоциации исследуемых мутаций с риском развития РМЖ, нами были проанализированы 564 образца ДНК больных РМЖ из Новосибирска и Кемерово.

Итак, результаты по первой группе мутаций.

Мутация BRCA1 5382insC была обнаружена в 20 образцах из 7920, что составляет 0,25%, и в 11 образцах больных РМЖ, что составляет 1,95%. Все образцы гетерозиготны.

Мутация BRCA1 4153delA не была обнаружена ни в популяционной выборке, ни в выборке ДНК больных РМЖ.

Мутацию BRCA1 185delAG содержал 1 из 564 образцов ДНК больных РМЖ (0,18%). В популяционной выборке указанная мутация не выявлена.

BRCA1 T300G обнаружилась в 4 образцах популяционной выборки (0,05%), что касается онкологической выборки – данные нами ещё не получены.

CHEK2 1100delC присутствует в 32 образцах из 7920 (0,4%) и в 10 образцах ДНК больных РМЖ (1,78%).

Таким образом, встречаемость мутации 5382insC в 7,8 раз, а мутации 1100delC – в 4,5 раза выше среди больных РМЖ, чем среди здоровых людей, что подтверждает литературные данные об ассоциации исследованных мутаций с риском развития РМЖ. Далее перейдём к результатам анализа мутаций, отнесённых нами ко второй группе.

Мутация BARD1 G1743C обнаружена в 313 образцах из 7920 (312 гетерозигот и 1 мутантная гомозигота), что составляет 3,95%. Из 564 образцов ДНК больных РМЖ данную мутацию содержали 25 (4,43%). Таким образом, ассоциация мутации BARD1 G1743C с риском возникновения РМЖ для исследуемой популяции не выявлена.

Мутация BARD1 T2006C обнаружилась в 1 образце из 7920 (0,01%), а BARD1 G2355A – в 10 образцах (0,13%). Данные по онкологической выборке нами ещё не получены.

Мутация BRIP1 C2392T была выявлена в 3 образцах ДНК из 7920. Ни один из образцов ДНК больных РМЖ данную мутацию не содержал. Поэтому для выявления связи (или её отсутствия) мутации BRIP1 C2392T с риском возникновения РМЖ необходима выборка больных РМЖ большего размера.

Таким образом, в связи с высокой встречаемостью можно рекомендовать проведение скрининговых исследований среди жителей г. Новосибирска на наличие мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC.