10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле.

Для проведения электрофореза в ПААГе мы использовали электрофоретический прибор Sequi-Gen ("Bio-Rad", США). В качестве электрофоретического буфера использовали 1 ТВЕ.

Для связывания геля со стеклом, одно из стекол обрабатывали "кислым" силаном (acid activated silane).

смеси, следующего состава: 9.375 мл 40% раствора акриламид-бисакриламид

х

(соотношение акриламид-бисакриламид 19:1), 15 мл 5 ТВЕ, 31.5 г мочевины и дистиллированная вода до необходимого объема. Затем добавляли 300 мкл ПСА и 60 мкл TEMED, тщательно перемешивали и заливали в прибор для полимеризации. Перед нанесением проб на гель проводили префорез при напряженности электрического поля 45 В/см в течение 1 ч.

Пробы для электрофореза в ПААГ готовили следующим образом: 2 мкл исследуемого продукта ПЦР смешивали с 6 мкл буфера для нанесения в ПААГ. Далее пробы прогревали при 100оС в течение 5 мин, охлаждали в ледяной бане, брали аликвоту 4 мкл и наносили на гель. Электрофорез проводили в течение 4-6 ч при 50оС и напряженности электрического поля 40-50 В/см (в зависимости от температуры геля).

По окончании электрофореза гель оставался на стекле, обработанным " кислым" силаном и его фиксировали в 10% уксусной кислоте в течение 20 мин. После фиксации гель отмывали 3 раза дистиллированной водой по 2 мин каждый раз. Затем проводили окраску раствором 1 для серебрения в течение 30 мин, промывали 20 сек дистиллированной водой и проявляли раствором 2 для серебрения в течение 1-5 мин (до появления окраски ДНК). Затем реакцию останавливали фиксацией в 10% уксусной кислоте в течение 5 мин и промывали водой. Результаты протоколировали с помощью сканера Mustek 1200SP.