Результаты исследований

2.2.1. Разработка алгоритма диагностики Malassezia-инфекций животных.

В настоящее время в ветеринарной практике не существует единого об­щепринятого алгоритма выявления грибов рода Malassezia на кожном покро­ве и в слуховом канале животных.

Для достижения искомого результата в рамках исследования предстояло: 1. Отработать оптимальный метод отбора патологического материала с кож­ного покрова, пригодный для повседневного применения в ветеринарной практике и отвечающий специфическим требованиям; 2. Изучить жизнеспо­собность грибов рода Malassezia в образцах патматериала, отобранных раз­личными методами; 3. Подобрать оптимальную питательную среду для вы­деления грибов рода Malassezia из патологического материала, метод посева и условия культивирования, с учетом физиологических особенностей возбу­дителя; 4. Разработать оптимальную схему видовой идентификации грибов рода Malassezia.

2.2.1.1. Сравнительная оценка методов выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных

В ходе исследования было апробировано несколько методов отбора па­тологического материала, используемых в ветеринарной микологии: 1) кож­ный соскоб с пораженного участка; 2) смыва; 3) контактных чашек («бакпе-

чаток»), 4) отбор пробы сухим ватным тампоном-зондом в стерильную про­бирку; 5) отбор пробы с помощью коммерческого коллектора, включающего ватный тампон-зонд и пробирку с транспортной средой Эймса.

Апробация методов проводилась на 27 собаках, подозреваемых на нали­чие Malassezia-инфекций как в форме кожных поражений (дерматитов), так и в форме отитов.

Результаты сравнительной оценки различных методов отбора патологи­ческого материала для выявления грибов рода Malassezia

Табл. 1

Сравнительная апробация данных методов отбора патологического ма­териала показала, что оптимальным для повседневного использования в ве­теринарной практике является метод с использованием ватного тампона- зонда (сухого или с транспортной средой). Использование тампона-зонда удобно, позволяет проводить отбор проб из труднодоступных участков тела (в т.ч. из слухового канала), а при посевах проб на питательные среды воз­можна количественная оценка плотности популяции дрожжевых грибов. Кроме того, использование тампонов-зондов, изготовляемых промышленным способом, позволяет стандартизовать процедуру отбора патологического ма­териала, что обеспечивает воспроизводимость и сопоставимость результатов микологического анализа.

С целью подбора оптимальной питательной среды для культивирования грибов рода Malassezia было проведено сравнительное изучение жизнеспо­собности 5 эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных пита­тельных средах. Для посева готовили взвеси дрожжевых культур в физиоло­гическом растворе и определяли концентрацию дрожжевых клеток в камере Горяева.

Были использованы наиболее доступные и распространенные микологи­ческие питательные среды: сусло-агар, среда Сабуро, среда Чапека; сусло- агар с добавлением селективной антибактериальной добавки хлорамфеникол, специализированные липид-содержащие питательные среды Барфатини и Диксона, а также среда ПД-2. Культивирование посевов проводили при 36°С,

т.к. эта температура многими авторами признана оптимальной для роста гри­бов рода Malassezia [59, 66, 76]. Наблюдение за посевами проводили еже­дневно, визуально отмечая начало роста грибных колоний.

Результаты определения жизнеспособности эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных питательных средах представлены в таблице 2.

Табл. 2

Жизнеспособность эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных питательных средах

Примечание: «с.ж.к.» - содержание жизнеспособных клеток относитель­но общей концентрации клеток гриба; Млн./см³ - общая концентрация дрож­жевых клеток; М - средняя арифметическая вариационного ряда; о - стан­дартное отклонение вариационного ряда.

Как показывают представленные данные, наибольшую жизнеспособ­ность культур М.

60,0±11,2% - 80,0±8,8% жизнеспособных клеток). При этом показатели жиз­неспособности М. pachydermatis на среде Барфатини и среде Диксона стати­стически не отличались (^=0,008 при Г_с„,=2,131).

Жизнеспособность М. pachydermatis на средах без липидов была стати­стически ниже, нежели на липид-содержащих средах. На среде Сабуро она составила 32,0±6,8% - 48,0±9,2% (Ґ0=3,43 при 4,„=2,13), на сусло-агаре 30,0±7,2% - 44,0±6,8% (//,=9,01 при /^/=2,13). Показатели жизнеспособности М. pachydermatis на среде Сабуро и сусло-агаре статистически не отличались (/0=0,08 при t_cm=2,13). Однако на среде ПД-2 жизнеспособность М. pachyder­matis составляла 34,0±9,6% - 50,0±6,4%, что статистически сопоставимо с уровнем жизнеспособности на среде Барфатини (//,=1,35 при /_см=2,13).

Жизнеспособность культур М. pachydermatis сусло-агаре с добавлением хлорамфеникола составила 16,0±6,4% - 28,0±5,6% и была статистически ни­же, нежели на сусло-агаре без селективной добавки (//,=3,57 при /,_т=2,13).

Среда Чапека оказалась непригодной для культивирования М. pachyder­matis.

Наиболее быстрое начало роста культур М. pachydermatis отмечали так­же на липид-содержащих средах Барфатини и Диксона - визуально рост ко­лоний на этих средах наблюдали уже на 2-е сутки, а у отдельных штаммов - спустя 24 ч. после посева. На средах без источников липидов (сусло-агар, среда Сабуро, ПД-2), выраженный рост у всех штаммов отмечали на 3-є сут., а на среде с хлорамфениколом — только на 4-е сут. Морфологические призна­ки колоний (форма, цвет, рельеф, характер поверхности, строение растущего края) становились отчетливыми на 4-5-е сут. на липид-содержащих средах и на 6-7 сут. на средах без источников липидов.

Исходя из полученных результатов, в дальнейшем для выделения грибов рода Malassezia из патологического материала была использована среда Бар­фатини, являющаяся липид-содержащией модификацией среды Сабуро.

для М. pachydermatis, среда Барфатини более доступна и проста в приготов­лении, что делает ее более предпочтительной для повседневной лаборатор­ной диагностики.

Однако недостатком данной среды является возможность роста конта- минантов, прежде всего бактериальных, что может исказить результаты ми­кологического исследования. С этой точки зрения для посевов патматериала целесообразно наряду со средой Барфатини использовать питательную среду с антибактериальной добавкой - в частности, сусло-агар с хлорамфениколом. При количественном учете колоний грибов на этой среде следует учитывать, что жизнеспособность М. pachydermatis на ней в среднем на 52,0% ниже, не­жели на среде Барфатини.

В повседневной лабораторной практике большое влияние на объектив­ность микологического анализа оказывают условия и сроки хранения патоло­гического материала. При этом далеко не всегда имеется возможность при­ступить к культуральному исследованию образцов непосредственно после их отбора. Исходя из этого, была поставлена задача определить сроки, в те­чение которых жизнеспособность грибов рода Malassezia в образцах патма­териала остается стабильной.

Пробы патологического материала отбирали с помощью ватного тампо­на-зонда в сухой коллектор и коллектор с транспортной средой Эймса. Отбор проб проводили от одного и того же животного с заведомым диагнозом Malassezia-отит. Было одновременно отобрано 5 проб в сухой коллектор и 5 проб в коллектор с транспортной средой Эймса, с соблюдением одинаковой методики отбора. Пробы хранились в холодильнике при 5-8°С, через опреде­ленные промежутки времени проводили высев образцов на питательную сре­ду Барфатини с последующим учетом выросших колоний грибов рода Malassezia.

Результаты определения жизнеспособности Malassezia spp. в образцах патматериала, хранившихся в сухом коллекторе и в коллекторе с транспорт­ной средой Эймса в течение 1, 2, 3, 5, и 7 сут. (рис. 1.)

срок хранения, сут.

—*— Сухой коллектор —о— Коллектор со средой Эймса

Рис. 1. Жизнеспособность грибов рода Malassezia в образцах патоло­гического материала при различных условиях хранения

Установлено, что жизнеспособность Malassezia spp в образцах патмате­риала, хранившихся в коллекторах с транспортной средой Эймса, статисти­чески не изменялась в течение всего срока хранения (^,=0,07 при t_cm=2,13) и составляла 143,1±7,8 КОЕ, или 104,4±5,7%.

В образцах, хранившихся в сухих коллекторах, жизнеспособность Malassezia spp сохранялась на исходном уровне в течение первых 2 сут. (93,4% и 97,9% от исходного значения), однако уже на 3-є сутки количество жизнеспособных дрожжевых клеток сократилось до 87,6 КОЕ, что составило 61,2% от исходного количества. На 7-е сут. из образцов было выделено лишь 16,3 КОЕ грибов (11,3%).

Таким образом, в условиях повседневной диагностической практики для отбора патматериала целесообразно использовать коллекторы с транспорт­ной средой Эймса, обеспечивающие сохранность Malassezia spp. в образцах в

течение длительного срока. При отсутствии коллекторов с транспортной сре­дой, тампоны-зонды можно хранить в сухих коллекторах или лабораторных пробирках с пробкой, но в этом случае культуральный анализ необходимо провести в течение 2 сут. после отбора образцов патматериала.

В результате проведенных исследований был разработан алгоритм вы­явления грибов рода Malassezia в организме животных, оптимизированный для применения в повседневной диагностической практике.

Рис 2. Алгоритм лабораторной диагностики Malassezia-инфекций

животных

Предложенный алгоритм включает: 1. Отбор патологического материала с помощью ватного тампона-зонда с транспортной средой Эймса; 2. Посев патологического материала на питательные среды — Барфатини и Сабуро с хлорамфениколом; 3. Культивирование посевов в течение 5-7 сут. при 36°С; 4. При наличии роста грибов рода Malassezia - количественный учет вырос­ших колоний (см. рис. 2). Полученные результаты позволили перейти к сле­дующим этапам исследования.

2.2.1.2. Изучение частоты встречаемости и плотности популяции гри­бов рода Malassezia в слуховом канале клинически здоровых животных

Учитывая, что грибы рода Malassezia являются представителями нор­мальной микробиоты кожного покрова теплокровных животных, для разра­ботки диагностических критериев необходимо было провести изучение рас­пространенности и плотности популяции этих микроорганизмов у клиниче­ски здоровых животных. Оценка плотности популяции микроорганизмов ис­пользуется и при диагностике микозов, вызываемых дрожжевыми грибами рода Candida, также являющимися представителями нормальной микробиоты теплокровных [9].

С этой целью был проведен микологический анализ секрета слухового канала, т.к. именно слуховой канал является оптимальной средой обитания для грибов рода Malassezia [34].

В эксперименте было использовано 27 клинически здоровых собак, ото­бранных методом случайной выборки вне зависимости от породы, пола и возраста и не имевших в анамнезе инфекционных и незаразных заболеваний. Отбор материала для микологического исследования во всех случая прово­дили одинаковым методом - ватный тампон-зонд через стерильный металли­ческий тубус вводили в слуховой канал, проворачивали вокруг оси на 360°, извлекали и помещали образец в коллектор с транспортной средой. Порядок проведения микологического исследования во всех случаях также был оди­наков. В случае выделения грибов рода Malassezia проводили количествен­ный учет выросших колоний.

Грибы Malassezia spp. были выделены из слухового канала у 9 из 27 кли­нически здоровых собак, при этом плотность популяции гриба колебалась от 1 до 18 КОЕ в образце, и лишь у собаки №2 она составила 43 КОЕ. Примеча­тельно, что при дальнейших клинических наблюдениях у этого животного были отмечены клинические признаки отита. Очевидно, в данном случае жи­вотное на момент исследования находилось в начальной стадии заболевания,

еще не перешедшего в клиническую стадию. Таким образом, выявляемость грибов рода Malassezia в слуховом канале здоровых собак составила 29,6%, при плотности популяции в среднем 7,0 КОЕ в образце. Результаты экспери­мента в табл. 3.

Частота выделения и плотность популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале клинически здоровых собак

Табл. 3