ДЕТЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов.
Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.Метод горизонтального электрофореза
Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру (Рисунок 22). Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, - например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).
Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.
Еще по теме ДЕТЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА:
- ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №8 Тема: Детекция ДНК методом гель-электрофорез
- Комплектация лаборатории № 3 (с детекцией методом электрофореза)
- ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ГЕМОГЛОБИНА
- Особенности протекания горизонтальных и вертикальных конфликтов
- Вопрос 1. Понятие горизонтальной и вертикальной интеграции
- 10. Гель-электрофорез.
- 10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле.
- Структурно-молекулярная детекция фибриногена у пациентов с СМД
- 2.2.1. Методы детекции видового состава микрофлоры урогенитального тракта женщин
- Анализ информации о качестве оказания медицинской помощи, полученной с помощью опросов пациентов и членов их семей
- Лекция 9. Тема: «Оказание помощи пострадавшим хирургического профиля. Организация неотложной помощи пострадавшим с синдромом «острая кровопотеря» на догоспитальном этапе».
- Лекарственная помощь как элемент медицинской помощи: понятие, правовое регулирование
- 3.1. Состояние качества медицинской помощи при оказании помощи паци- ентам с болезнями системы кровообращения в амбулаторно- поликлини- ческих учреждениях в Санкт-Петербурге в 2009 году.
- Глава 1 Определение, содержание и философия паллиативной помощи. Принципы паллиативной помощи и формы ее организации
- Протокол профилактики стоматологических заболеваний и оказания специализированной помощи пациентам с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области Скорая медицинская помощь
- Бригады доврачебной помощи и фельдшерские выездные бригады скорой медицинской помощи.
- Приложение 2 Основные группы пациентов, подлежащих педиатрической паллиативной помощи (Европейская ассоциация паллиативной помощи, 2009)
- ТЕМА № 6. Организация лечебно-профилактической помощи детям. Детская поликлиника: задачи, структура, показатели деятельности. Организация стационарной помощи детям.
- 4.1. Анализ оказания медицинской помощи пациентам в мегаполисе на догоспитальном, госпитальном и постгоспитальном этапах Догоспитальный этап оказания медицинской помощи