ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ГЕМОГЛОБИНА

Разделение НЬ, содержащихся в крови человека, производится путем электрофореза. Существуют различные методики и аппараты. Мы пользуемся электрофорезом на ацетатцеллюлозных пленках с помощью прибора, сконструированного СКВ БФА в 1973 г., модель ЭФЛА 250-0,05.

Ниже приводится методика проведения электрофореза.

64

Реактивы:

1. Трис-буфер для электродов (рН-9,0): борная кислота - 0,92 г; трис-трисгидрометиламинометан-12 г; ЕДТА(этилендиаминочетырехуксусная кислота) - 1,56 г; дистиллированная вода до 1000 мл.

2. Красящий раствор: амндошварц - 1г; сульфатсалициловая кислота -3 г; трихлоруксусная кислота - 3 г; дистиллированная вода - 100 мл.

3. Отмывающий раствор: метиловый спирт - 50 мл; ледяная уксусная кислота - 10 мл; дистиллированная вода - 40 мл.

Ход определения: камеру заливают буфером до одинакового уровня в кювете. Любую хроматографическую бумагу, смоченную буфером, накладывают в два слоя на края рамки, и концы ее опускают в буфер.

Пленки из ацетатцеллюлозы размером 25х 120 мм, смоченные в буфере, слегка промокают фильтровальной бумагой и помещают в камеру матовой поверхностью вверх на края рамок, покрытых бумажными мостиками. На каждую полоску наносят прямой линией 0,005 мл раствора гемолизата (см, методику приготовления гемолизата ниже), содержащего 8-10% НЬ. Для нанесения используют кисточку или специально сделанный штамп. Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока для электрофореза типа ПВ Эф-1. Разделение проводят при силе тока 1 mА на 1 пленку в течение 2-х часов при напряжении 250 вольт. Пленки красят в течение 10 мин. с последующим многократным (4-5 раз) промыванием в отмывающем растворе, а затем в воде (отмывание проводят до получения белого фона). После отмывки пленки высушивают фильтровальной бумагой.

Получаемые при этом фракции НЬ представлены на рис.

Рис. 14. Электрофорез НЬ на ацетатцеллюлозной пленке. Верхняя фореграмма - донор; нижняя - больной СКВ. Обозначения: 1. Точка отсчета-места нанесения гемолизата. 2. Малая фракция взрослого НЬ - НЬА2 3. HbS. 4. HbA.

Гетерозиготный пациент (собственные оригинальная Э-фореграмма и фото).

65

У здоровых людей на электрофорефамме выявляется также HbF- между А2 и А, ближе к последнему У больных СКБ HbF располагается между HbS и А. Все это затрудняет определение количества HbF по апектрофореграммам, поэтому обычно его определяют по методу Бетке (см. ниже).

Количественное определение гемоглобиновых фракций проводится путем элюирования окрашенных фракций. Окрашенную ацетатцеллюлез-ную пленку разрезают на зоны, соответствующие фракциям НвА, НвА,, HbS, видимые на глаз и помещают в пробирки, содержащие 20 и 4 мл элюи-рующего раствора и элюируют в течение 30 минут.

Для элюирования применяют 2% раствор двууглекислого натрия (Na2CO3) в 50% этиловом спирте.

Полученные при элюировании растворы фотометрируют на спектрофотометре (СФ 16) против элюирующего раствора или воды при длине волны 615 ммк. Количество НЬА2 вычисляют по формуле: Е 615 ммк НЬ2 х 100, а А - Е 615 ммк НЬА2 + 5 х (Е 615 ммк НЬА), где Е - оптическая плотность.

Приготовление гемолизатов проводится следующим образом: берется венозная кровь с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта используется нефракционированный гепарин (1-2 капли на 4 мл крови). Кровь центрифугируют от 3 до 5 мин. и надосадочный слой отсасывают пипеткой. Оставшиеся в пробирке эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором с последующим центрифугированием и удалением верхнего слоя. Отмытые эритроциты лизируют добавлением равного объема воды и 0,5 объема четыреххлористого углерода: пробирки энергично встряхивают в течение 10 мин., после чего смесь центрифугируют 40-50 мин. при 5-ти тысячах оборотов в минуту. Потом надосадочный прозрачный гемолизат осторожно переносят пипеткой в другую пробирку, в которой он может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение нескольких месяцев.