4 Выделение золотистого стафилококка

4.1 Для выделения и количественного учета золотистого стафилококка из молока от одного животного (из удоя или отдельных четвертей вымени), а также из сборного молока и молочных продуктов используют ускоренный метод, который основан на применении элективной, дифференциально-диагностической среды - ДНК-новокаинового агара (рецепт № 2).

Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие - добавлением натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибонуклеазной активности.

4.2 Проведение исследований. Из доставленных проб молока готовят разведения 1:10 и 1:100 на стерильном физиологическом растворе.

В чашку Петри с ДНК-новокаиновым агаром (рецепт №2) вносят 0,1 мл молока из разведения 1:100 и равномерно распределяют стеклянным шпателем по всей поверхности питательной среды.

Засеянные чашки помещают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38°С в течение 22-24 часов. На ДНК-новокаиновом агаре золотистый стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями.

Для выявления ДНК-азной активности золотистого стафилококка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают 5-7 мл 1N раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают 2-3 минуты, за которые вокруг колоний образуются круглые зоны просветления. Затем кислоту осторожно сливают и приступают к учету результатов исследования. В том случае, если культура стафилококка была выделена на кровяном агаре, то ДНК-азная активность может быть определена путем пересева на ДНК-агар (рецепт № 4).

Определение ДНК-азной активности может быть проведено при выращивании изолированной культуры.

4.3 Учёт результатов исследования. Чашки просматривают в проходящем свете. Обнаружение колоний, окруженных зоной просветления с четкими границами, указывает на наличие в исследуемом материале золотистого стафилококка.

Для определения количества золотистого стафилококка в 1 мл исследуемого материала подсчитывают колонии с зонами просветления по всей поверхности среды, и полученное число колоний умножают на 10 (т.к. высевали 0,1 мл) и на степень разведения материала.

Например: Высеяно 0,1 мл молока из разведения 1:100. В результате подсчета получено 15 колоний. Следовательно в 1 мл молока - 15000 микробных клеток золотистого стафилококка (15x10x100).

4.4 При высеве образцов на кровяной агар учитывают рост выпуклых колоний с гладкой или шероховатой поверхностью, в которых при микроскопии обнаружены грамположительные кокки, расположенные в виде гроздеподобных скоплений, тетрами или одиночно, выделенную культуру относят к стафилококкам и проверяют на каталазную активность. Для этого часть колоний растирают в капле 10%-ной перекиси водорода, нанесенной на предметное стекло. Каталазоположительные стафилококки содержат фермент каталазу, который при контакте с перекисью водорода образуют интенсивное газообразование.

Одновременно по изменению кровяного агара учитывают гемолитические свойства стафилококков. На кровяном агаре с эритроцитами крупного рогатого скота растут стафилококки, обладающие альфа-гемолитическими свойствами (прозрачная зона вокруг колоний), бетта-гемолитическими свойствами (матовая зона гемолиза), чаще со смешанным альфа и бетта-гемолизом; иногда зона гемолиза отсутствует.

4.5 Для определения плазмокоагуляции стафилококков, делают высев полученной культуры в пробирки с мясо-пептонным бульоном и через 3 часа выращивания в термостате при 37°С ставят реакцию плазмокоагуляции с цельной или сухой плазмой крови кролика.

Плазму крови кролика разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5 и разливают в агглютинационные пробирки по 0,5 мл. Бульоннную культуру стафилококка по 0,1 мл (2 капли) вносят в пробирки с разведенной плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуру, а в другую - засевают заведомо плазмокоагулирующий стафилококк.

При положительной реакции плазмокоагуляции образовавшийся сгусток не выпадает из пробирки при наклоне или плавает в плазме.

4.6 Определение отношения к манниту в анаэробных условие. 3-4 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка высевают в пробирку с 0,16%-ным полужидким агаром, содержащим 0,5% маннита и индикатор Андреде, под вазелиновым маслом (рецепт 5). Посевы инкубирует при температуре 37°С. Результат учитивают через каждые 24 часа. Окончательный результат получают через 5 суток. Изменение цвета индикатора (появление розового окрашивания) указывает на ферментацию маннита в анаэробных условиях, что является дифференцирующим характериным признаком для золотистого стафилококка.

4.7. Постановка реакции фаготипирования стафилококка. Поскольку фаги высушивают в объеме 0,1 мл, то при добавлении 1 мл МПБ(с 0,4% глюкозы и 0,2% CaCl₂) получают основное разведение 10^-1 (1:10). Из этого основного разведения готовят два рабочих разведения, соответствующие 1 тест-разведению (ТP) и 100 ТР. Разведение, соответствующее 1 TP, указано на этикетке фага.

Бактериофаги в жидком состоянии следует хранить при температуре 4°С. Основное разведение фагов 10^-1 при таком способе хранения можно использовать в течение 1,5-2 месяцев. Разведение_, соответствующее 1 ТР, следует готовить заново каждые 7 дней из основного разведения 10^-1.

4.7.1 Методика фаготипирования. Суточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в 2,5 мл бульона Хоттингера, Мартена или мясо-пептонного бульона (рH 7,2-7,4) и выращивают 3-4 часа при 37°С (до появления заметной мути). Одновременно готовят чашки с 1,2%-ным агаром, приготовленным на бульоне Хоттингера, содержащего 200 мг аминного азота, 0,4% глюкозы и 0,02% CaСl₂ (рецепт 6).

По 25-30 мл расплавленного агара разливают в чашки Петри и после застывания его подсушивают 30-40 минут при 37°С.

Дно засеянной чашки расчерчивают карандашом на квадраты по трафарету соответственно числу используемых фагов и в каждый квадрат засеяннной среды пипеткой вертикально наносят каплю соответствующего фага. Один квадрат оставляют для контроля без фага. После нанесения каждого фага пастеровскую пипетку (наконечник) выбрасывают. После подсыхания капель фага чашки переворачивают вниз и инкубируют 5-7 часов при температуре 37°С, а затем оставляют на 18-20 часов при комнатной температуре.

Для нанесения фагов на чашки с агаром может быть использован специальный аппарат для фаготипирования стафилококков. Аппарат состоит из 25 металлических стержней, вмонтированных в квадратную пластинку, соединенную с поршнем. Основанием прибора служит площадка из органического стекла, на которой находится свободно передвигающаяся вторая площадка с гнездом для фиксирования засеваемой чашки и пластинки из фторопласта с резервуаром для фагов. В резервуары фторопластовой пластинки, помещенной в стерильную чашку Петри, наливают по 3-5 капель фагов (всегда в одном порядке). Чашку с агаром и пластинку с фагами помещают на подвижную пластинку. Поочередным передвижением площадки устанавливают под металлическими стержнями сначала пластинку с фагами, а затем чашку с агаром. Опуская и поднимая, стержни с помощью поршня, переносят капли фагов на чашку с агаром, едва касаясь его поверхности. Чашки меняют в зависимости от числа типируемых культур.

Чашки с фагами оставляют на столе на 30-40 минут и затем их орошают 4-часовой бульонной культурой стафилококков. После подсыхания культур чашки переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30°С или 5-3 часов при 37°С и оставляют до следующего утра при комнатной температуре.

Фаготипирование штаммов начинают с 1 TP (тест-разведения). Штаммы, которые не лизировались хотя бы одним фагом, на следующий день типируют повторно со 100 ТР.

4.7.2 Учет и регистрация результатов. Степень лизиса культуры разными разведениями фага регистрируют по следующей схеме: (++++) - сливной полный лизис, (+++) - полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса), (++) - наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 пятен лизиса, (+) - от 20 до 50 пятен лизиса, (-) - полное отсутствие лизиса. Для упрощения схемы учета степени лизиса обозначения ++++, +++, ++ и называемые "сильной реакцией", можно регистрировать одним обозначением. ++.

Штамм считается типируемым, если хотя бы один фаг вызвал сильную реакцию. Если при типировании культуры фагом 1 ТР получены только слабые реакции или лизис полностью отсутствует, то такой штамм типируют повторно фагом в 100 ТР или считают нетипируемым, (если его типировали 100 ТР). Результаты типирования peгистрируют, записывая против названия штамма разведение фагов, с помощью которых был получен положительный результат (1 ТР ила 100 ТР), а также номера фагов, обусловивших сильную реакцию. Отдельно в скобках следует записать наличие слабых реакций, если таковые имелись.

Стафилококковые штаммы чаще лизируются не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную фагомозаику.

Если культуры стафилококка при типировании в один и тот же день дают мозаики, различающиеся на одну сильную реакцию, их следует считать идентичными; если разница составляет две и более сильные реакции, штаммы следует признать разными.

4.8 Оценка результатов. Стафилококки, обладающие гемолитической активностью, плазмокоагулирующими свойствами, разлагающие маннит в аэробных и анаэробных условиях, фаготитруемые относят к золотистым – Staph. aureus.

4.9 Срок лабораторного исследования идентификации стафилококков - 3 дня, при необходимости фаготипирования и определения отношения к манниту - 5 дней.