Создание генно-инженерных штаммов Вас. subtilis

Природные штаммы Вас. subtilis синтезируют рибофлавин только в количествах, необходимых для поддержания собственной жизнедеятельности и совсем не выделяют его в среду. Во ВНИИ ге­нетики и селекции промышленных микроорганизмов под руководством А.И.

На втором этапе были получены мутации в гене регуляторе (ribC). Совмещение в одном штамме мутаций rosR и ribC позволило получить штамм со сверхсинтезом рибофлавина, продуцирующего на синтетических средах до 100 мг/л витамина. На следующем этапе получены мутации устойчи­вости к аналогу пурина, 8-азагуанин, что также привело к росту продукции рибофлавина. У таких мутантов разрегулирован синтез пуринов. В этом случае увеличение продукции можно объяснить возрастанием накопления ГТФ — предшественника рибофлавина в его биосинтезе. Данный штамм Вас. subtilis ВНИИгенетика 304 на комплексных питательных средах, содержащих в качестве ис­точника углерода сахарозу или глюкозу, а в качестве ростовых факторов дрожжи, синтезировал до 1 г/л витамина В₂. Синтезированный рибофлавин свободно выходит через клеточную стенку в культуральную среду, и в концентрациях около 1 г/л кристаллизуется в виде игольчатых крис­таллов желтого цвета, хорошо видимых под микроскопом.

В дальнейшем был создал рекомбинантный штамм Вас. subtilis. Под термином «рекомбинантный штамм» понимают штамм микроорганизма, который содержит одну или более нуклеотидных пос­ледовательностей из этого же или другого организма на сайте, где данная последовательность отсут­ствует у дикого штамма, или же такая последовательность представлена в виде нескольких копий.

Генно-инженерными методами была сконструирована рекомбинантная плазмида рМХ45, несу­щая на себе разрегулированный рибофлавиновый оперон Вас. subtilis и ген устойчивости к эритро­мицину. Данная плазмида была введена в штамм Вас. subtilis ВНИИгенетика 304, что за счет увели­чения количества копий рибофлавинового оперона дало возможность получать до 3-4 г/л витамина на комплексных питательных средах. В результате дальнейших селекционных работ были полу­чены мутанты, ауксотрофные по аденину, и мутанты с нарушенной транскетолазой и глутаматсин- тазой. Среди штаммов, ауксотрофных по аденину (т.е. таких, которые для своего роста требуют наличие в среде аденина) был отобран штамм с увеличенной продукцией витамина, что можно объ­яснить возрастанием пула ГТФ в клетке в результате изменений в регуляции синтеза пуринов.

233

Основным источником углерода при биосинтезе молекулы рибофлавина является рибулозо-5'- фосфат, которая образуется в пентозофосфатном цикле, увеличение накопление ее пула в клетке связано с мутацией про транскетолазе, ферменту катализирующему перенос кетольной группы с фруктозо-6-фосфата или гептулозо-5-фосфата на альдофосфат. Такая мутация имеет плейот- ропный эффект и, кроме повышения пула рибозы, приводит к нарушению транспорта глюкозы в клетку и к нарушениям в утилизации пентоз и в биосинтезе ароматических аминокислот. У му­тантов с дерепрессированным синтезом рибофлавина блок транскетолазной реакции неизбежно должен способствовать увеличению биосинтеза рибулозо-5-фосфата, который затем направляется в сторону образования пуриновых нуклеотидов и усиления флавиногенеза.

Для синтеза молекулы рибофлавина клетке требуется азот. Согласно общепринятому мнению два соединения L-глутамат и L-глутамин являются основными поставщиками азота у бактерий. Основным донором азота для синтеза изоаллоксазинового кольца рибофлавина является глутамин. Но в клетке глутамин под действием глутаматсинтазы превращается в глутамат. Поэтому, чем ни­же активность глутаматсинтазы, тем большее количество глутамина может быть использовано на синтез пуринов и рибофлавина. Это объясняет увеличение продукции рибофлавина у мутантов с нарушенной глутаматсинтазой.

Все это, наряду с усовершенствованием состава сред и условий культивирования, позволяет по­лучать в настоящее время до 20-25 г/л рибофлавина как в опытно-промышленных, так и в промышленных условиях.

4.