Факторы, влияющие на осаждение

Растворы культуральной жидкости могут быть различного происхождения: экстракты из сухих культур микроорганизмов, фильтраты из гомогенатов растительных и животных тканей, лизаты микроорганизмов, фильтраты культуральной жидкости, получаемой при глубинном выращива­нии микроорганизмов.

Типисевл ^’ Л.

VIO помимо целевого продукта большое количество растворимых в воде соединений и веществ ОЛЛОЯДЯОЙ. природы. Выделение определенного соединения из этой сложной смеси представляет

„елейные трудности, так как система очень чувствительна к внешним воздействиям, и поэто- ° обеспечение высокого выхода целевого продукта в осадок требует строгого соблюдения условий, п^и которых начинается агрегирование выделяемых молекул или других соединений и выпадение

Остановимся на особенностях осаждения белковых препаратов. Известно, что гидрофобные группы белка стремятся сконцентрироваться внутри белковой молекулы, но все нее значительная их часть находится на поверхности молекулы. Растворимость белка в различных растворителях во многом определяется распределением гидрофобных и гидрофильных остатков на поверхности молекулы. Так как основным растворителем белков является вода, то, изменяя некоторые свой­ства воды (температуру; ионную силу, pH, добавление нейтральных солей, водорастворимых орга­нических соединений или других инертных соединений), можно создать определенное окружение белковой молекулы, повлиять на ее гидратный или сольватный слой и вызвать агрегацию бел­ковых молекул и выпадение их в осадок.

Чаще всего для осаждения соединений со сравнительно высокой молекулярной массой приме­няются водорастворимые органические соединения и соли. Процесс агрегации схематически пред­ставлен на рис. 30.

Помимо осадителей на образование осадков влияют многие факторы, такие как размер моле­кул, природа осадителя и др.

Наличие в растворе некоторых ионов может оказывать стабилизирующее влияние на фермент. Так, ионы Са²⁺ способствуют сохранению активности а-амилаз, протеиназ, глюкоамилаз; за­щитным действием обладают ионы магния, марганца, кобальта. В то нее время ряд ионов (Fe²⁺, Pb²⁺, Си²', Ag', Ni2+, Al³⁺, Hg²⁺ и др.) действует отрицательно и их присутствие крайне нежела­тельно. Наличие электролитов часто позволяет снизить расход осадителя и улучшить структуру

осадка.

Температура раствора и растворителя. При осаждении белковых препаратов следует стремить­ся, чтобы она была по возможности низкой. Это связано с тем, что смешивание спирта и водного раствора фермента сопровождается выделением тепла, температура смеси повышается на 5—10 °С, и, если спирт предварительно не охлажден, происходит денатурация белка.

Значение pH среды. Очень большое значение при осаждении белков имеет pH среды. Из одного и того нее раствора при различном значении pH можно получить различное количество осадка. Это связано с тем, что наиболее полно ферменты выпадают в изоэлектрической точке, когда создаются наиболее благоприятные условия для агрегирования белковых молекул. Процесс осаждения бел­ков, в изоэлектрической точке без применения осаждающих реагентов называется изоэлектричес­ким осаждением. Использование органических осадителей при pH, близком к изоэлектрической точке, позволяет ускорить осаждение и использовать растворители более низких концентраций. При отклонении величины pH от изоэлектрической точки выход осадка падает до 30—50 % макси­мальной величины. Поэтому необходимо строго соблюдать режим поддержания оптимального зна­чения pH в момент осаждения органическими растворителями.

Концентрация сухого вещества в исходном растворе. Мак­симальный выход БАВ в препарат и наиболее стабильная структура осадка получаются при содержании сухого вещества не более 10—12 % .

Рис.

Длительность контакта с растворителем. Следует стремить­ся сократить это время до минимума, чтобы уменьшить денату­рацию белка. Максимального сокращения продолжительности контакта осадка с растворителем можно достичь в неп­рерывных осадителях, которые все шире используются в отече­ственной ферментной промышленности.

Установки для осаждения белков. Схема такой установки приведена на рис. 31. Установка состоит из сборника фермен­тного раствора 1, смесителя непрерывного действия системы автоматизации. Смеситель представляет собой вер- икальный цилиндрический корпус 1, внутри которого распо- °жен шток 2. На штоке установлены распорные втулки 3, чередующиеся с перегородками 4. не доходящими с одной

Рис. 31. Установка для непрерывного осаждения белков а — общая схема: 1 — сборник для исходного раствора; 2 — мерник для спирта;

3,4 — ротаметры; 5 — смеситель; 6 — сепаратор; б — смеситель непрерывного действия конструкции ВНИИ биотехники: 1 — корпус; 2 — шток; 3 — распорные втулки; 4 — перегородки; 5 — гайка; 6 — уплотнение

стороны до стенок цилиндра. На боковой верхней части вертикального цилиндра имеются штуце­ра для подачи исходного раствора и растворителя. В нижней части цилиндра расположен спускной штуцер для выхода смеси. Движущиеся сверху вниз по сложной траектории жидкости в течение короткого времени полностью смешиваются. Образующийся осадок непрерывно отделяется в сепа­раторе. При таком способе осаждения продолжительность контакта белков и растворителя сокра­щается в десятки раз, а выход в осадок повышается на 15-20 % .

Отделенный на сепараторе осадок может быть высушен в вакууМ-сушильном шкафу, на субли­мационной сушилке или после растворения в минимальном количестве воды (при введении соот­ветствующего наполнителя или стабилизатора) в распылительной сушилке. Отсепарированная надосадочная жидкость, содержащая 50-75 % растворителя, направляется на регенерацию в рек­тификационное отделение. После регенерации растворитель вновь поступает на производство на стадию осаждения, а кубовый остаток, содержащий почти все сухое вещество культуральной жид­кости или экстракта из поверхностной культуры, может быть использован вместе с биошротом для приготовления кормов.

Выход препарата при осаждении органическими растворителями зависит от состава среды, на которой выращивался микроорганизм, и степени предварительного концентрирования раствора

3.6.2.