Осаждение высаливанием

Процесс высаливания в основном зависит от степени гидрофобности белковой молекулы. Ти­пичная белковая молекула имеет гидрофобные участки на поверхности в виде боковых цепей ряда аминокислот (тирозин, триптофан, лейцин, изолейцин, метионин, ватин и фенилаланин).

Различные белки по-разному реагируют на процесс высаливания. Это зависит в первую очередь от количества и размеров гидрофобных участков на поверхности белковой молекулы. Чем больше таких участков, тем легче идет высаливание белков. При осаждении ферментов из сложной смеси разнообразных белков имеет место явление соосаждения. После дегидратации белковых молекул в растворе солей молекулы белка агрегируют не с идентичными, а с любыми другими «клейкими» молекулами, находящимися поблизости. Это приводит к получению препаратов, обогащенных различными сопутствующими балластными веществами. Однако при высаливании можно добить­ся не только осаждения всего комплекса, но и его фракционирования.

Для высаливания в основном используются нейтральные соли щелочных металлов. Высалива ющий эффект различных ионов зависит от их ионной силы. По силе высаливающего действия ани­оны натриевых солей можно расположить в следующий ряд:

(SO₄)-₂ > СН₃СОО > Cl- -- NO“₃ > I- >CNS~, а катионы — LP > Na' >К⁺ >(NH₄)’.

При высаливании сложных биохимических смесей соль может взаимодействовать и с другими соединениями, вызывая их осаждение. Поэтому высоленные или осажденные растворителями БАВ содержат до 60—85 % балластных сопутствующих веществ. Для высаливания могут быть ис­пользованы сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат цинка и хлористый натрий. Наиболее час­то используют сульфат аммония, реже — хлористый натрий. Наибольшее осаждение молекул про­исходит при концентрации соли в растворе, близкой к концентрации насыщения. Но это не всегда удобно, так как в осадок увлекается большое количество соли, что требует дополнительной очис­тки препаратов и затрудняет их применение. Обычно осаждение ведут раствором с концентрацией соли 0,5—0,9 от полного насыщения, но и в этом случае в препараты переходит от 20 до 80% соли от массы осадка.

Самая сложная стадия процесса высаливания — это внесение соли и способ ее растворения. Соль измельчают и медленно добавляют небольшими порциями при постоянном перемешива­нии, чтобы избежать локальных зон повышения концентрации соли в растворе. При перемеши­вании может наблюдаться вспенивание раствора, которое нежелательно, так как при попадании БАВ в пузырьки пены он может денатурироваться в результате воздействия поверхностного на­тяжения. Поэтому перемешивание должно быть умеренным, без пенообразования. После введе­ния последней порции соли перемешивание следует продолжать еще 20-40 мин до достижения полного равновесия между растворенными и агрегированными белками. Образование осадка на­чинается со слабого помутнения, которое постепенно переходит в суспензию со взвешенными хлопьями. Процесс формирования осадка зависит от температуры, объема обрабатываемой жид­кости, pH среды и может длиться от 20-40 мин до нескольких часов. Повышение температуры при высаливании благоприятствует быстрому агрегированию молекул в крупные хлопья, поэто­му процесс ведут при 20-30 °С. При высаливании можно добиться частичного фракционирова­ния комплекса веществ.

В целом высаливание — очень сложный технологический процесс, зависящий от множества факторов, особенно в заводских условиях. Кроме того, важно помнить, что соль никогда не осаж­дает высокомолекулярные соединения полностью, а только снижает их растворимость. Например, если содержание высаливаемого белка в исходном растворе составляет 1 мг/мл и в результате добавления соли растворимость его понижается в 10 раз (до 0,1 мг/мл), это значит, что 90% белка выпало в осадок при высаливании. Однако, если исходная концентрация 0,1 мг/мл, то при том же содержании соли в растворе осаждения белка не будет.

3.6.3.