3-2. Изучение синтеза Rpf и его гомологов М. tuberculosis в растущей культуре

3.2.1- Синтез Rpf в растущей культуре М, luteus

Чтобы ответить на вопрос о биохимических свойствах Rpf и о механизме его действия па бактериальную клетку и культуру в целом, необходимо было решить ряд задач, одной из которых было изучение того, сколько белка и на каких стадиях роста М luteus продуцируется в среду.

Для оценки количества Rpf в культуральной жидкости использовали ряд биохимических и молекулярно-биологичесхих методов: иммуноферментный анализ с поликлональными антителами против Rpf (Рис.12), иммуноблоттинг с теми же антителами (Рис. 13-14) и ОТ-ПЦР (RT-PCR) для оценки наличия в клетках мРНК, специфической для Rpf (Рис.15-16).

57

10 р

ODuoo

0.1

0.01 **

20 40

время_tч

- 4

- 2

60

Rpf отн. ед.

ODuoo

_В

0-01

0 40 80 120 160 200'240 280

время, ч

Рис. 12, Динамика накопления Rpf в процессе роста клеток M.tuteus. Rpf детектировали при помощи ИФА в супернатаптах культур М. luteus. А - клетки выращивали на богатой среде Broth E, В - клетки выращивали на среде LMM (лактатная минимальная среда).

_IZ

Как видно из рисунка 13А, количество Rpf достигает детектируемого уровня через 5 часов после засева ипокулята, максимум белка приходится на позднюю логарифмическую фазу роста культуры, в стационарной фазе количество белка быстро падает, приближаясь к нулю в райоИе 50

часов. В случае с бедной средой (Рис.13В), количества начинает расти при переходе культуры от лаг-фазы к логарифмическому делению и так же, как и в случае богатой среды быстро падает после наступления стационарной фазы.

58

Для иммуноблоттинга в качестве исследуемых образцов использовали фильтрованную через

0,22 цм бактериальный фильтр культуральную жидкость М.

При этом было установлено, что белок Rpf активно секретируется в культуральную жидкость на протяжении всей логарифмической фазы роста культуры MJuteus, при этом концентрация Rpi возрастала примерно пропорционально плотности клеток. Максимум концентрации Rpf при

г

выращивании М. luteus на богатой мясопептонной среде Broth E приходится на переход из логарифмической в стационарную фазу роста культуры и достигает 1-2 мг нативного белка Rpf на литр культуры (Рис. 13). В поздней стационарной фазе роста культуры M.luteus содержание Rpf в культуральной жидкости падает до практически недетектируемых значений (Рис. 14).

59

Рис. 13. Динамика накопления Rpf в сужрнатанхе культуры М, Ынчкч при росте на богатой среде, летек трудная при помощи тшуноблоттипга, К"А - О\~)^\-0,?.9, V«2 - ОП^- 0*4* ХнЗ --ОПщгМХЧ, Х^4 - ODfif;."- 1,4, 4*5 - ОТУмх, '6,0- Ни рисунке видно, что с ростом оптической плотности кулг>туры RpT нодтнфгасгеи 6o:ie(но;^[,иян логарифмическая фаза), Х$3 — ОО^ц— 8,0(ршшяя стационарная фа>а), №4 - ОПщ|~ 6,7{поздняст стационарная ф;т*а).

Диализ декретируемой формы наганного Rpf с помощью SDS электрофореза обнаружил, что уже I? ранней стационарной фазе роста культуры гсоданшюЕцее количество Rpf и суиернаганте подвергалось деградации, ь поздней стационарной фазе Rpf не летектирустея, за исключением

61

форм с высокой молекулярной массой (около 60-80 кДа"), которые образуются на поздних стадиях и, возможно, представляет собой какую-то модифицированную форму белка не подверженную деградации.

Для изучения уровня экспрессии белка Rpf использовали метод RT-PCR (ОТ-ПЦР), позволяющий оценивать количество специфической для данного белка мРПК. Для этого брали выровненные количестиа клеток М. luteus ira разных стадиях роста культуры, выделяли из них тотальную РПК и при помоши специфических праймеров получали к-ДНК к мРНК Rpf в реакции обратной траскрипции. Полученый фрагмент ДНК в дальнейшем амплифицировали в ходе полимеразной цепной реакции и конечный продукт выявляли с помощью электрофореза в

агарозномгелс.

•J . " -Ъ::¹*:.к

■ 1 ^

Щ «ft

Ы• ■'•mfc'",•>*

А Ж- '•'

■, '-

Рис.15. Уровень экспрессии Rpf на разных стадиях роста культуры A/, htieus методом RT-PCR. 1 -OD&oc = 0, 046 начало логарифмической фазы, 2 - OD^o ⁼ 0_?S2 ранняя логарифмическая фаза, 3 -ООбсс = 4,4 поздняя логарифмическая фаза, 4 - OD_tco = 3,8 стационарная фаза, 5 - ОП^оо ~ 3.6 поздняя стационарная фаза. Стрелкой указан интересующий нас фрагмент к-ДНК, рядом с каждой дорожкой присутствует контроль (система без обратной транскриптазы).

Как видно из представленного рисунка мРПК Rpf присутствует па всех стадиях роста культуры, в том числе на самых ранних, за исключением стационарной фазы, когда синтез белка полностью прекращается, причем в поздней логарифмической фазе, когда самого белка еите много синтез его

62 мРНК уже mmmi\c:r сегцжсться. D дело^, ладные РТ-ПЦР подтверждают нтляод о продукции RpJ

получаемую ш>& помощи Ы-f^A я Ещмунашошнга.

3*2.2. Научение TKcnptn-BiKi гонов гомологов НрГв культуре Д£ Utbercuhsh

Эксисримешыгю тучен изо :>Kcirpexcrm генов белков ссмейпва Rpfпроводилась намл совместно с Го:;ударгли1ш;_:ш научзгым центром нрше/га/шой миЕфобгтопопш. В ланпом зхсн^риьЕсшс при нимоиш ОТ--ПЦР оценивалось количество мРНК псех *>яти гомологов Rjnf и двухнедельной к>л:,турс мешрулсшного шгамма М. tuberculosis. (Academic Результаты iroro окспертген'к*, предстшздшш^ешриеЛб евндетедьет!>уюто чта:, что мРНК всех пяти гомологов Rpf иркглтстнусч и клетках растущей культуры АУ inhercukws, что может еш'дете^ьет'юшггь о том* что скорее всего, вес пять белков семеаспш Rpf "женр ее сирую гея и культуре.

* *■;■ ;">'""" * . "" 'Si