ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Микромицеты рода Candida из состава нормальной микробиоты тела человека могут быть возбудителями внутрибольничного инвазивного кандидоза. Ежегодно в мире выявляют до 200000 пациентов с внутри- больничным инвазивным кандидозом (ИК), из которых 100000 больных умирают [115].

Известно, что лишь у 50 - 75% больных ИК удается выявить Candida spp. при посевах крови. Даже в случаях, когда удается выделить культуру Candida, большинство используемых в микробиологической лаборатории методов видовой идентификации дрожжей обеспечивают получение резуль- тата только через 2 суток и более. Кроме того, особую проблему составляет быстрая и надежная идентификация C. не-albicans видов [37]. В последние годы все чаще сообщают о появлении резистентных штаммов возбудителей ИК [39]. Однако, существует не только проблема устойчивости Candida spp. к противогрибковым препаратам, но и проблема выбора метода определения чувствительности клинически значимых дрожжей к антимикотикам.

Несмотря на перспективность современных методов молекулярной биологии для точной видовой идентификации и быстрого выявления рези- стентности грибов к противогрибковым препаратам, использование этих методов в повседневной диагностической практике ограничено.

Таким образом, быстрое установление этиологии ИК и определение чувствительности возбудителей к противогрибковым препаратам современ- ными методами является актуальной проблемой.

Степень разработанности темы

В последние годы, благодаря внедрению современных методов, в том числе ДНК-секвенирования и технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии,

этиология ИК в ряде зарубежных стран постоянно уточняется [35].

В период с 2003 по 2008 гг. в России в рамках многоцентрового глобального исследования ARTEMIS DISK была определена чувствительность возбудителей ИК к флуконазолу (78%) стандартизованным диско-диффузионным методом CLSI M44-A [15].

Однако отсутствуют сведения о чувствительности возбудителей ИК в РФ к антимикотическим препаратам, в том числе сравнительно нового поколения: вориконазолу, каспофунгину и позаконазолу, полученные рефе- рентными методами. Введение новых критериев интерпретации результатов определения чувствительности для основных возбудителей ИК, предложен- ных Европейским комитетом по определению чувствительности микро- организмов к антибиотикам (EUCAST, 2012 г.) и Институтом по клини- ческим и лабораторным стандартам (CLSI, США, 2012 г.) обусловило необходимость проведения оценки различных методов определения чувстви- тельности Candida spp. к противогрибковым препаратам [40].

Цель исследования - изучить особенности возбудителей внутри- больничного инвазивного кандидоза для оптимизации лабораторной диа- гностики.

Задачи исследования:

1. Определить видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в стационарах РФ с помощью современных методов иден- тификации.

2. Сравнить используемые методы видовой идентификации Candida spp. и выявить наиболее эффективные для применения в рутинной практике.

3. Определить чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к современным антимикотикам с помощью стандартизованных методов (CLSI

M27-A3, CLSI M44-A) и микробиологического анализатора (VITEK 2

Compact).

4. Сравнить используемые методы определения чувствительности Candida spp. к современным антимикотикам и выявить наиболее эффективный для применения в рутинной практике.

5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики внутрибольничного инвазивного кандидоза.

Научная новизна исследования

Впервые:

1. Установлена этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ современными молекулярно-биологическими методами. Соотношение видов C. albicans и C. не-albicans видов составляет 1:1,3. Выявлены географические особенности этиологии инвазивного кандидоза в различных регионах России.

2. Определены профили чувствительности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в России референтным методом CLSI M27-A3 к следующим противогрибковым препаратам: флуконазолу, вориконазолу, каспофунгину, позаконазолу.

3. Установлены диапазоны МПК, МПК50, МПК90 флуконазола, вориконазола, каспофунгина, позаконазола для возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в России.

4. Определены масс-спектро-профили возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза, в том числе редких видов Candida; внутри вида C. parapsilosis выявлено 5 субкластеров.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты диссертационного исследования вносят вклад в изучение глобальных тенденций в этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза и определение чувствительности возбудителей ИК к анти- микотическим препаратам; они также важны для быстрой и точной иден- тификации патогенов - возбудителей внутрибольничного инвазивного канди-

доза. Собранная в результате исследования коллекция чувствительных и резистентных к противогрибковым препаратам изолятов Candida spp. от пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом депонирована в Российскую коллекцию патогенных грибов и служит основой для изучения молекулярных механизмов резистентности к азоловым препаратам. Разработан алгоритм лабораторной диагностики возбудителей внутри- больничного инвазивного кандидоза с помощью современных методов.

Методология и методы исследования

Данная диссертационная работа - многоцентровое исследование. Объекты исследования – культуры Candida spp., выделенные от пациентов с внутри- больничным инвазивным кандидозом.

Положения, выносимые на защиту:

1. Возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза в России представлены основными видами Candida spp. (96%): C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii и редкими (4%): C. lusitanie, C. dubliniensis, C. pararugosa, C. bracarensis, C. kefyr, C. lipolytica, C. utilis, C. inconspicua.

2. Распространенность C. albicans как основного возбудителя инвазивного кандидоза в России снизилась с 54% в 2012 г. до 32,8% в

2014 г. (р=0,015), C. parapsilosis - возросла с 9,8% (2012 г.) до 27,8% (2014 г., р=0,01), тогда как уровень C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei остается неизменным.

3. Чувствительность изолятов C. не-albicans видов к флуконазолу in vitro составила 58%, к вориконазолу - 95,7%. К каспофунгину все штаммы возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза были чувствительны.

Степень достоверности и апробация результатов диссертационного исследования

Степень достоверности результатов, полученных при проведении иссле- дования, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выбор- ки выполненных исследований, подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов соответствуют поставленным задачам.

Материалы диссертационного исследования представлены на конферен-

циях и конгрессах:

международных – 12-я конференция Американского общества микро-

биологов «Candida и кандидоз», США, 2014 г.,

европейских: 23-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Германия, 2013г.; 6-й конгресс «Тенденции в медицинской микологии», Дания, 2013г.; 24-й Европейский конгресс по кли- нической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Испания, 2014 г.,

российских: Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.); отчетные сессии научных под- разделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова, (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.). По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в т. ч. 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный вклад диссертанта. Автор лично выполнил основные микро- биологические исследования по теме диссертации, статистическую обра- ботку, анализ полученных данных, обобщение и оформление результатов.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на

146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литера- туры, описания методов и материалов исследования, результатов работы, заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация содержит 25 таблиц и 42 рисунка. В работе использованы 30 отечественных и 154 ино- странных источников литературы.