.Непрямой иммуногистохимический метод исследования

Начальным этапом непрямого иммуногистохимического исследования была подготовка срезов. Для этого их наклеивали на стекла, обработанные полилизином, распарафинивали, блокировали эндогенную пероксидазу раствором перекиси водорода в метаноле и выполняли демаскировку антигенов путем нагревания в трис-ЭДТА или цитратном буфере в течение 30 мин при температуре 95°С на водяной бане (рисунок 2.6).

Для иммуногистохимической детекции субпопуляций лимфоцитов, дендритных клеток и пролиферативной активности клеток использовали первичные мышиные и кроличьи моноклональные античеловеческие антитела (Таблица 2.2). Время инкубации с первичными антителами составляло 18-20 часов при t°= +40°C.

Рисунок 2.6 – Схема проведения непрямой иммуногистохимической реакции

Таблица 2.2 – Первичные античеловеческие антитела

Для детекции клеток использовали полимерную систему визуализации Envision (Dako, Дания), где в качестве хромогена применяли диаминобензидин (ДАБ) (Dako, Швеция), и двойную систему визуализации Multivision Polymer (Thermo Fisher Scientific, США).

– 30 мин. при температуре +20°С. для проявления результата реакции ДАБ наносили на срезы на 5 мин.

Двойная система детекции «Multivision Polymer Detection System: Multivision anti-rabbit/HRP + anti-mouse/AP polymers» – набор для иммуногистохимического выявления (окрашивания) двух антигенов в одном срезе (гистологическом препарате). Она состоит из смеси антивидовых антикроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и антивидовых антимышиных антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой и двух разных хромогенов (дополнительные реагенты). Пероксидаза хрена при расщеплении своего хромогена дает красное окрашивание, щелочная фосфатаза – синее. Данная система позволяет проанализировать взаимное расположение двух разных антигенов в одном препарате, при условии, что хозяева первичных специфических антител к этим антигенам разные – кролик и мышь.

Выполнялось определение количества окрашенных цветовой меткой (позитивных) клеток при 200–кратном увеличении светового микроскопа в трех полях зрения (размерами 720?530 мкм), выбранных с учетом наибольшего количества меченых клеток, используя компьютерную программу анализа изображения «UTHSCSA ImageTool 3.0» (Рисунок 2.7) и программное обеспечение «Морфология 5.2» (ВидеоТесТ, Россия) (Рисунок 2.8, рисунок 2.9, рисунок 2.10). Полученные данные заносили в базу данных в виде среднего числа позитивных клеток на изучаемой площади среза (0,38 мм2), посчитанных для каждого биоптата.

Определяли относительную площадь экспрессии, которую рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах.

Индекс пролиферативной активности определяли как отношение количества Ki-67-позитивных клеток к общему количеству ядерных клеток в поле зрения, выраженное в процентах.

Коэффициент эпидермо-дермального отношения определяли как отношение площади, занимаемое выявляемым маркером в эпидермисе к площади в дерме.

Рисунок 2.7 – Интерфейс программы анализа изображения «ImageTool 3.0»

Рисунок 2.8 – Интерфейс программного обеспечения «Морфология 5.2».

Детекция определяемых клеток

а б

в г

Рисунок 2.9 Иммуногистохимическое исследование кожи больных грибовидным микозом: а, в – до модификации программой «Морфология»; б, г – модификация изображения программой «Морфология». анти-CD3 – желтое окрашивание, анти-Ki-67 – красное окрашивание. а, б – увеличение ?200; в, г – увеличение ?400

Рисунок 2.10 – Интерфейс программного обеспечения «Морфология 5.2». Определение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками