Морфологические и иммуногистохимические исследования.

Морфологические исследования проведены в соответствии с общепринятыми стандартами, включая проводку, фиксацию материала, приготовление гистологических срезов с последующей окраской гематоксилин-эозином.

Методика иммуногистохимических исследований.

Ткань аденоидных вегетаций и небных миндалин фиксировалась в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. Затем подвергалась спиртовой дегидратации, парафинизации, заливке на блоки по обычным прописям, принятым в патоморфологических лабораториях.

Далее блоки использовались для ИГХ-исследований. Для этих целей на микротоме готовились гистологические срезы толщиной 4 мк. Срезы помещались на предметные стекла, покрытые силаном (Dako, Дания). После тщательного высушивания, стекла подвергались депарафинизации в грех объемах ксилола, по 5 мин. в каждом, с последующей регидратацией в батарее, состоящей из одного объема абсолютного спирта и двух объемов 95 этанола. По окончании этапа регидратации и отмывки в буферном растворе (PBS, pH 7,4) приступали к иммуногистохимическому этапу.

Перед нанесением первичных МАТ, поверхность гистологического среза обрабатывалась либо 0,05% раствором фермента нроназы в течение 5 мин., либо подвергалась термической обработке при 95 в течение 30 мин в буферном растворе (Target Retrieval Solution, Dako, Дания) с целью восстановления структуры антигенных детерминант на клеточной поверхности, изменившихся в процессе фиксации ткани. Вариант обработки выбирался в зависимости от вида МАТ, согласно инструкции фирмы- производителя. Затем, после отмывки в забуференном фосфатами физиологическом растворе (PBS), препарат обрабатывался пероксидазным блоком в течение 5 мин. По окончании инкубации и отмывок в PBS, на

препарат наносились МАТ в рабочих разведениях и инкубировались в течение 30 мин.

Для визуализации АГ-реактивных клеток использовалась тест-система EnVISION +SYSTEMS, PEROXIDASE (DAB), Dako, которая является более чувствительной по сравнению с тест-системами, основанными на пероксидазо-антипероксидазном или на авидин(стрептавидин)-биотиновом принципе.

После обработки первичными МАТ, препараты тщательно отмывались и на них наносились вышеуказанные вторичные антитела. По окончании 30- минутной инкубации при комнатной температуре и после тщательной отмывки, АГ-рсактивные клетки визуализировались хромогенным субстратом (3,3-диаминобензидин в буферном растворе). Препараты докрашивались водным раствором гематоксилина в течение' 30 сек., обрабатывались в растворе 37 мМ аммония для подсинивающего эффекта. Затем препараты регидратировались в спиртах, осветлялись в двух объемах ксилола и заключались в канадский бальзам. При просмотре препаратов АГ- позитивные клетки (DAB-позитивныс) идентифицировались по их коричневому окрашиванию на светооптическом уровне. Ядра остальных клеток окрашивались в синий цвет гематоксилином.

Использование каждого вида МАТ сопровождалось постановкой негативного контроля на тех же самых срезах. С этой целью вместо МАТ на препарат наносился раствор негативного контроля, состоящий из иммуноглобулиновой фракции сыворотки неиммунных мышей в 0,05М трис­буфере, pH 7,6. Все остальные этапы анализа были аналогичными. В качестве позитивного контроля использовались препараты интактной небной миндалины, прилагаемой фирмой-производителем к набору МАТ. Этот контроль был использован с целью оценки морфологии и ИГХ-картины интактной ткани лимфоидного глоточного кольца без воспалительного процесса. Иммуноморфологическая оценка препарата начиналась с просмотра препарата негативного контроля. В случае отсутствия

прокрашивания, в т.ч. и фонового, приступали к анализу исследуемых препаратов.

Иммуногистохимические исследования операционного материала на готовых парафинизированных блоках были проведены на базе патологоанатомического отдела РОНЦ РАМН им.

Для интерпретации полученных данных важно знать характеристики использованных МАТ. Они следующие.

1. МАТ к CD3-AT (Novocastra Lab. Ltd., Великобритания). Клон PSI, класс и субкласс иммуноглобулинов - IgG2a. Антитела к е-цепи CD3- пептидной молекулы, состоящей из пяти полипептидных молекул массой от 16 до 28 kD. СОЗ-комплекс четко ассоциирован в лимфоцитах с поверхностным Т-клеточным рецептором ( TCR-receptor). Все Т-лимфоциты несут этот рецептор, следовательно, позитивная реакция на этот АГ тестирует наличие совокупной Т-клеточной популяции. Считается, что указанный комплекс вовлекается в проведение АГ-специфичного сигнала после контакта Т-лимфоцита с антиген-презентирующими клетками. Эти МАТ взаимодействуют с Т-клетками тимуса, костного мозга, периферической лимфоидной ткани и крови. МАТ были готовы к употреблению ( N-серия антител ). Гистологический срез, перед нанесением МАТ обрабатывался в цитратном буфере при t =95° С в течение 10 мин.

2. МАТ к CD4-AT (Novocastra Lab. Ltd., Великобритания). Клон 1F6, класс и субкласс иммуноглобулинов - IgGl. CD4 молекула является одноцепочечным трансмембранным гликопротеином с молекулярной массой 59 kD. Этот белок присутствует на мембране субпопуляции Т-лимфоцитов - Т-хелперах/индукторах. МАТ взаимодействуют с Т-хелперами, присутствующими в тимусе, периферической лимфоидной ткани и крови. С целью повышения информативности проводимых исследований рекомендуется использовать эти МАТ в комплексе с МАТ к CD3 и CD8- антигенам. МАТ были готовы к употреблению ( N-серия антител ).

Гистологический срез обрабатывался в цитратном буфере при 1=95° С в течение 10 мин.

3. МАТ к CD8-AT (Dako Corporation, Дания-США). Клон С8/144В, класс и субкласс иммуноглобулинов - IgG2b. МАТ взаимодействуют с полипептидом масса 32 kD, эквивалентному молекуле CD8. Эта молекула экспрессируется на мембране субпопуляции l'-лимфоцитов - Т- цитотоксических/сунрессорных клетках. МАТ взаимодействуют с Т- цитотоксическими клетками периферической лимфоидной ткани, селезенки и крови.

4. МАТ к CD20-AT (Dako Corporation, Дания-США). Клон L26, класс и субкласс иммуноглобулинов - IgG2a. МАТ данного вида взаимодействуют с двумя нековалентно связанными компонентами массой от 33kD до 30 kD, присутствующими на В-лимфоцитах как крови, так и лимфоидных тканей. Иммуногистохимическая реакция тестируется на цитоплазматической мембране. В работе использовались МАТ N-серии, готовые к употреблению. Предварительная обработка гистологического среза не требовалась.

5. МАЛ’ к IgG человека (Dako Corporation, Дания-США). Клон А57Н. МАТ интенсивно взаимодействуют с IgG-содержащими плазматическими клетками и их предшественниками, включая В-лимфобласты. Основная масса фолликулярных дендритных клеток лимфоидного глоточного кольца и герминативных центров лимфоидных фолликулов являются позитивными на наличие поверхностного IgG. Антитела перед работой разводились в соотношении Г.25. Гистологический препарат предварительно обрабатывался ферментом проназой.

6. МАТ к IgA человека (Dako Corporation, Дания-США). Клон 6Е2С1. МАТ взаимодействуют с тяжелой цепью ( a-цепь) двух IgA-изотипов ( IgAl и IgA2 ). Антитела взаимодействуют с плазматическими клетками и их предшественниками, включая В-лимфобласты. Около 10% мантийной зоны

лимфоидных фолликулов является позитивными на IgA. Антитела разводились перед работой в соотношении 1:25, а гистологический срез предварительно обрабатывался ферментом проназой.

7. МАТ к IgM человека (Dako Corporation, Дания-США). Клон R1/69. МАТ взаимодействуют с тяжелой цепью человеческого IgM. Антитела взаимодействуют с В-лимфоцитами лимфоидных фолликулов глоточного лимфоидного кольца. Наиболее выражена реакция в первичных лимфоидных фолликулах. Во вторичных лимфоидных фолликулах поверхностный IgM на лимфоидных клетках контрастирует мантийную зону, образую грубую сстчатость этих зон на препарате. Антитела также разводились перед работой в соотношении 1:25, а гистологический срез обрабатывался ферментом проназой.

2.6.