Методика иммуногистохимических исследований

Ткань аденоидных вегетаций и небных миндалин фиксировалась в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. Затем подвергалась спиртовой дегидратации, парафинизации, заливке на блоки по обычным прописям, принятым в патоморфологических лабораториях.

Далее блоки использовались для ИГХ-исследований. Для этих целей на микротоме готовились гистологические срезы толщиной 4 мк. Срезы помещались на предметные стекла, покрытые силаном (Dako). После тщательного высушивания, стекла подвергались депарафинизации в трех объемах ксилола, по 5 мин. в каждом, с последующей регидратацией в батарее, состоящей из одного объема абсолютного спирта и двух объемов 95 этанола. По окончании этапа регидратации и отмывки в буферном растворе (PBS, pH 7,4) приступали к иммуногистохимическому этапу.

Перед нанесением первичных МАТ, поверхность гистологического среза обрабатывалась либо 0,05% раствором фермента проназы в течение 5 мин., либо подвергалась термической обработке при 95 в течение 30 мин в буферном растворе (Target Retrieval Solution, Dako) с целью восстановления структуры антигенных детерминант на клеточной поверхности, изменившихся в процессе фиксации ткани. Вариант обработки выбирался в зависимости от вида МАТ, согласно инструкции фирмы-производителя. Затем, после отмывки в забуференном фосфатами физиологическом растворе (PBS), препарат обрабатывался пероксидазным блоком в лечение 5 мин. По окончании инкубации и отмывок в PBS, на препарат наносились МАТ в рабочих разведениях и инкубировались в течение 30 мин. при комнатной температуре. Для визуализации АГ-реактивных клеток использовалась тест- система EnVISION +SYSTEMS, PEROXIDASE (DAB), Dako, которая

является более чувствительной по сравнению с тест-системами, основанными на пероксидазо-антипероксидазном или на

авидин(стрептавидин)-биотиновом принципе.

После обработки первичными МАТ, препараты тщательно отмывались и на них наносились вышеуказанные вторичные антитела.

Использование каждого вида МАТ сопровождалось постановкой негативного контроля на тех же самых срезах. С этой целью вместо МАТ на препарат наносился раствор негативного контроля, состоящий из иммуноглобулиновой фракции сыворотки неиммунных мышей в 0,05М трис- буфере, pH 7,6. Все остальные этапы анализа были аналогичными. В качестве позитивного контроля использовались препараты интактной небной миндалины, прилагаемой фирмой-производителем к набору МАТ. Этот контроль был использован с целью оценки морфологии и ИГХ-картины интактной ткани лимфоидного глоточного кольца без воспалительного процесса. Иммуноморфологическая оценка препарата начиналась с просмотра препарата негативного контроля. В случае отсутствия прокрашивания, в т.ч. и фонового, приступали к анализу исследуемых препаратов.

Иммуногистохимические исследования операционного материала на готовых парафинизированных блоках были проведены на базе пагологоанатомического отдела РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина ( зав. профессор Н.Н.Петровичев).

2.5.