4.2Морфологическая и биологическая характеристика клинических изолятов C. neoformans

Использованные в работе штаммы криптококков характеризовали по морфо-биологическим свойствам. Штаммы образовывали слизистые блестящие колонии светло-кремового или кремового цвета при температуре инкубации 37 ° С на агаре Сабуро в течение 3-х суток.

[172].

Средний диаметр клеток штаммов C. neoformans определяли в пределах от

7,20 ± 0,06 мкм до 14,33 ± 0,51 мкм. При микроскопии у всех штаммов криптококка выявляли капсулу, размер которой также значительно варьировал от

1,66 ± 0,07 мкм до 8,70 ± 0,54 мкм (таблица 6).

Таблица 6 – Морфометрия капсулы штаммов C. neoformans и размера клеток на

3-и сутки инкубации при 37° C.

а)

Рисунок 4 – Световая микроскопия препаратов в туши (ув.

а) C. neoformans РКПГ Y 1106, толщина капсулы 8,70±0,54 мкм;

б) C. neoformans РКПГ Y 1276 толщина капсулы 1,97±0,08 мкм.

Фенолоксидазная активность криптококков является одним из факторов патогенности. Оценку фенолоксидазной активности проводили по способности к меланинообразованию. Установлено, что при выращивании криптококков при температуре близкой к окружающей среде 28° С, все исследуемые культуры были способны к образованию меланина уже на 1-е сутки инкубации. Полученные результаты варьировали от видимого отсутствия пигмента на поверхности колоний (0 баллов) до коричневой окраски образовавшегося пигмента (3 балла). При температуре человеческого тела 37° С, способность к меланинообразованию была выражена значительно меньше. Образование пигмента наблюдали только ко второму дню исследования, а у некоторых штаммов (РКПГ Y 1276, Y 1257, Y

1106, Y 1262, Y 1164) пигмент не накапливался и на третьи сутки инкубации при

37° С. Результаты экспериментов представлены в таблице 7.

Таблица 7 – Способность к меланинообразованию штаммов C. neoformans разной вирулентности при температурах 28° С и 37° С в зависимости от степени накопления пигмента на среде с L-ДОФА.

Примечание. Способность штаммов C.

Видовую идентификацию грибов проводили с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии белков в культуре. Был подтвержден вид криптококков и установлен вариант C. neoformans.

Таблица 8 – Результаты видовой идентификации C. neoformans, полученные методом MALDI-TOF MS.

Все штаммы, используемые в эксперименте, были отнесены к виду Cryptococcus neoformans, у 9 штаммов был определен var. grubii, у 3 штаммов - var. neoformans. Большинство штаммов удалось идентифицировать с высоким значением коэффициента достоверности (2,1-1,9). Однако у 4 штаммов РКПГ: Y

1175, Y 1178, Y 1257 и Y 1272 коэффициент идентификации при многократных повторных определениях не превышал значения порядка 1,9.

Кроме того, ранее три из исследованных штаммов (РКПГ Y 1164, РКПГ Y

1165, РКПГ Y 1175) были идентифицированы в лаборатории молекулярной микологии Центра инфекционных заболеваний и микробиологии (Австралия, г. Сидней), методами ПЦР-отпечатков с праймером М13 и RFLP (Restriction Fragment Length Poiymorphism) гена URA5 с использованием рестриктаз Hhal и Sau96. Результаты по определению вида и варианта для этих трех штаммов криптококков, полностью совпали с нашими исследованиями, полученными методом MALDI-TOF MS.

Таким образом, подтверждена возможность видовой идентификации криптококков и определение варианта возбудителя методом масс- спектрометрического анализа.