Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов в экспериментах in vitroи in silico

Опасности для здоровья человека, связанные с воздействием фуллеренов, в данный момент недостаточно охарактеризованы, и необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы количественно охарактеризовать эти эффекты в целях полноценной оценки риска.

частности, в качестве радиопротекторных агентов [80, 38], антиоксидантов и акцепторов свободных радикалов [19, 74, 140, 153,8б], в качестве компонентов лекарственных препаратов, обладающих в некоторой степени антипролиферативными [59, 190], противоопухолевыми [75, 73, 72, 180, 183], противовирусными [150, 139]и нейропротекторными свойствами [148, 149, 184], а также для эффективной доставки лекарственных средств [9б,104, 50]. Следует также иметь в виду, что по мере расширения производства и промышленного применения фуллеренов их определённые количества смогут поступать в окружающую среду и становиться значимыми контаминантами экосистем и пищевой продукции [25].

Как показали исследования на клетках E.coli,фуллерен С_б0 не был генотоксичен в SOS-хромотесте [8]. Этим результатам, однако, противоречат данные работы [54], в которой воздействие водных дисперсий С_б0 на клетки бактерий Pseudomonas putidaи Bacillus subtilisв концентрации 0,01 - 0,5 мг/л, вызывало значительную модификацию свойств клеточных мембран и значимое ингибирование их роста. Согласно [3б] солюбилизированный

поливинилпирролидоном фуллерен вызывал повреждение клеток E.coliпо механизму развития оксидантного стресса.

В основе наблюдаемой токсичности фуллерена лежат фотоиндуцированные физико-химические и клеточные процессы, включая окислительные, генотоксические [97, 175]и цитотоксические реакции, одной из главных причин которых является образование фуллеренами активных форм кислорода [91].

Для выяснения параметров токсичности коллоидных частиц фуллерена С_б0 и С₇₀[83]проводили эксперименты в бесклеточной системе, содержащей фуллерен и молекулы белков (БСА). С использованием метода ядерного магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля, метода

асимметрического фракционирования течением под влиянием поля (AFFFF) и метода динамического лазерного светорассеяния (фотонная корреляционная спектроскопия, ФКС) показано, что наночастицы комплексов фуллеренов с белком в культуральной среде не принимают жесткую сферическую структуру, а имеют скорей гибкую структуру. Поскольку углеродные наноматериалы одинакового химического состава, но с различными геометрическими структурами обладают абсолютно разной биологической активностью и цитотоксичностью, это может оказывать разнообразные воздействия на процессы поглощения этих частиц клетками, что имеет немаловажное значение для оценки токсичности in vitro.

В исследовании [93]с использованием методов пространственного компьютерного моделирования показано, что фуллерены могут выступать в качестве блокаторов или модуляторов мембранных K⁺каналов. Данный эффект, сопряжённый с возможным цитотоксическим действием, послужил основанием для другого исследования методом компьютерного моделирования, где были выявлены наиболее благоприятные белки-мишени для производных фуллерена [66].

По современным представлениям для фуллеренов характерна способность к взаимодействию с биологическими макромолекулами с возможной модификацией их свойств. Путем компьютерного моделирования в работе [189]установили, что молекулы С₆₀ могут препятствовать репарации ДНК. Для взаимодействия фуллеренов с белками характерен, по-видимому, эффект их солюбилизации в гидрофобном ядре глобулы таких крупных белков, как сывороточный альбумин (М=67кД).

Существует значительное число экспериментальных результатов, показывающих, что немодифицированные фуллерены, как в виде индивидуальных молекул, так и мультимолекулярных коллоидных частиц, могут поглощаться различными клетками высших животных в культуре. Так, кератиноциты человека быстро захватывали ¹⁴С-меченный фуллерен C₆₀, вводимый в виде мультимолекулярных ассоциатов диаметром 3 мкм [145]. По мнению авторов работы после адгезии этих ассоциатов (не относящихся с точки зрения их размера к НЧ) к плазматической мембране клетки может происходить диффузия отдельных молекул фуллерена C60 через липидный бислой. Согласно данным [110]наблюдается активный фагоцитоз полиморфноядерными нейтрофилами мультимолекулярных коллоидных частиц фуллерена C₆₀. Авторы исследования [162]наблюдали поступление молекул фуллерена C60 в клетки зачатков конечностей эмбриона крысы; в качестве формы введения использовали дисперсию частиц фуллерена C60, стабилизированную поливинилпирролидоном. Как показано в работах [129, 130]агрегированные частицы фуллерена C60 захватываются макрофагами человека и выявляются затем методом просвечивающей электронной микроскопии в цитоплазме, лизосомах и, что наиболее существенно, в ядре клеток.

Таким образом, высокая гидрофобность фуллеренов, с одной стороны, ограничивает возможность их контакта с клетками ввиду малой растворимости в воде и, с другой стороны, является причиной высокой мембранотропности этих веществ. В модельной системе показано [134], что фуллерен C60 способен проходить через липидный бислой мембраны в течение нескольких миллисекунд, в то время, как водорастворимый фуллеренол C60(OH)20 через мембрану практически не проникает [152].

мультимолекулярных агрегатов с их последующей дезинтеграцией внутри клетки [19].

В большом числе исследований было показано, что фуллерены обладают низкой цитотоксичностью для различных клеточных культур in vitro.Так, авторами работы [110]показано, что коллоидная дисперсия C⅛ не проявляла цитотоксического действия в отношении лейкоцитов человека. Этот же препарат согласно данным [145]не влиял на скорость синтеза ДНК и пролиферацию кератиноцитов человека. Фагоцитоз частиц фуллерена микронного размера не вызывал увеличения секреции провоспалительного интерлейкина 1β [112]. При действии на бычьи альвеолярные макрофаги фуллерен С_б0 проявлял значительно меньшую цитотоксичность в сравнении с референтными НЧ кварца (кристаллического диоксида кремния) DQ12 [27]. В культуре J774 макрофагов крысы фуллерен не стимулировал выделение окиси азота, не вызывал апоптоза и гибели клеток [5б]. Инкорпорированный в липосомы фуллерен не проявлял фотоцитотоксичности в отношении фибробластов мыши [8б]. Аналогично не было выявлено токсичности C₆₀в виде мультимолекулярной дисперсии в отношении человеческих моноцитов, лейкоцитов и макрофагов [47]. В этой же работе установлено, что фуллерен не влиял на рост в культуре ряда видов прокариот, включая E.coli, P.aeruginosa, S.typhimurium, S.aureus, L.monocytogenes, E.hirae, B.cereus, B.subtilis, B.pumilus,а также дрожжей C.albicans.В работе [173]не наблюдали угнетающего действия фуллерена для E.coliили B.subtilisпри концентрации 340 мкг/мл в течение 16 ч. На клеточной линии мыши BALB/3T3 показано, что раствор фуллерена Сбо, солюбилизированного

поливинилпирролидоном, не мутагенен и не оказывает на клетки трансформирующего действия [141].

В работе [15б] сообщается об исследованиях агрегации, клеточного поглощения и цитотоксичности фуллеренола. Выявлено, что C₆₀(OH)⅛ показал высокую токсичность для клеток легких и яичника китайского хомяка, но почти

не повлиял на культуру клеток L929, в связи с чем можно предполагать, что цитотоксичность фуллеренола проявляется избирательно, в зависимости от конкретного типа клеток. Эти данные не подтверждается результатами работы [116], в которой фуллеренол С₆₀(ОН)₂₄ не проявлял цито- и генотоксических свойств в отношении яйцеклеток хомяка даже при заведомо агравированной дозе, составившей 2 мМ (более 2 мг/мл культуральной среды). В работе [39], выполненной на клетках гемолимфы мидий, отмечали усиление под действием наночастиц фуллерена выделения из клеток лизоцима и реакционноспособных соединений кислорода, включая оксид азота, в разной степени в зависимости от концентраций и размера применяемых наночастиц. Провоспалительное действие наночастиц было опосредовано быстрой активацией стресс-активированного р38 и митоген-активированной протеин киназы. Результаты показывают, что у двустворчатых моллюсков иммунная система является, по-видимому, мишенью воздействия наночастиц фуллерена.

Таким образом, представленные данные указывают в основном на отсутствие у немодифицированных фуллеренов цитотоксичности. Однако, большинство из цитированных выше работ проводились с клеточными культурами в темноте. Учитывая наличие у немодифицированного фуллерена сильно выраженных фотосенсибилизирующих свойств [19, 188], следует ожидать, что характер цитотоксического действия этих соединений при освещении может быть принципиально иным. Действительно, в исследовании [161]показано светозависимое цитотоксическое действие фуллерена C₆₀, солюбилизированного поливинилпирролидоном.

солюбилизированный циклодекстрином, проявлял на свету высокую цитотоксичность для клеток хрусталика человека. Процесс гибели клеток протекал по типу апоптоза и опосредовался образованием синглетного кислорода.

Авторы работы [24]оценили безопасность водорастворимых фуллеренов, включенных в поливинилпирролидон (ПВП/фуллерены) в качестве антиоксидантов в косметических и фармацевтических препаратах путем изучения генотоксичности, фототоксичности и прооксидантных эффектов самих фуллеренов. Полученные авторами работы солюбилизированные формы фуллерена не обладали мутагенными свойствами при тестировании на любых штаммах бактерий и не вызывали хромосомных аберраций в культурах клеток млекопитающих. ПВП/фуллерены не проявляли цитотоксичности при облучении ультрафиолетом или при симулировании альтернативных испытаний на фототоксичность. Кроме того, они не демонстрировали какого-либо про- оксидантного эффекта в присутствии Fe²⁺или Cu²⁺. По мнению авторов ПВП/фуллерены являются безопасными для использования в косметической и фармацевтической промышленности.

Авторы работы [85]растворяли фуллерен C⅛ в сквалене и изучали его защитные эффекты против воздействия 2,4-нонадиеналя (НДН) на HaCaT кератиноцитах и оценивали образование морщин в трехмерной ЭЭ-модели кожи человека. НДН является аналогом 4-гидроксиноненаля, являющегося одним из основных веществ, создающих запах человеческого тела, свидетельствующий о старении, и, одновременно, липофильным фактором повреждения клеток. Жизнеспособность кератиноцитов, выраженная в % от контроля, снизилась до 31,6% при обработке НДН в концентрации 40 мкМ, но увеличилась до 66,0-97,5%, когда раствор фуллерена в сквалене вводили за 5 часов до добавления НДН. Защитный эффект препарата был значительно большим, чем от одного только сквалена в тех же дозах. Раствор фуллерена в сквалене также защищал клетки от повреждения ДНК и апоптоза. На основании этих данных предполагается, что фуллерен C60, растворенный в сквалене, малотоксичен для клеток кожи и его

можно использовать в качестве косметического ингредиента против формирования морщин.

В дискуссионной работе [57]сопоставлено взаимодействие двух химически модифицированных производных фуллерена, гексакарбоксильного аддукта фуллерена (гекса-Сбо) и трискарбоксильного аддукта фуллерена (трис-Сбо) с чистым фуллереном C6o,инкапсулированным в у-циклодекстрин (CD-Сбо), на модели клеток эпителия кожи человека для моделирования возможных последствий профессиональной кожной экспозиции. Исследовали жизнеспособность клеток, внутриклеточную генерацию реакционноспособных форм кислорода (РСК), клеточную пролиферацию и изменения клеточного цикла. В частности показано, что трис-С_б0 индуцировал ответы, связанные с консервацией клеток на G(0)/G(1) фазах клеточного цикла и клеточным старением. Механизмы наблюдаемых эффектов могут быть связаны с воздействием фуллерена на активность клеточной убиквитин лигазы из семейства HERC, принимающей участие во врожденном иммунном ответе на вирусные и бактериальные инфекции.

Авторы работы [8б] наносили липосомы, содержащие фуллерен, на поверхность трехмерной модели ткани человеческой кожи, затем промывали и облучали УФ-излучением при 4 Дж/см², а затем повторяли обработку еще в 19 циклах в течение 4 дней (в сумме 76 Дж/см²). С помощью сканирующего электронного микроскопа были обнаружены последствия УФ облучения, такие как увеличение и нарушение рогового слоя эпидермиса, разрушение коллагена типа I / IV, расщепление ДНК нити и пикноз/кариорексис. Эти повреждения были частично подавлены ненагруженными липосомами, но в значительно большей степени липосомами, содержащими фуллерен, в концентрации до 0,75 мг/л Сбо- эквивалента. В этих условиях фуллерен С_б0 проникал в эпидермис при концентрации 1,86 нмоль/г ткани (1,34 ppm), что соответствует 0,3 % от применяемого количества. Важно отметить, что фуллерен С_б0 в этих экспериментах не был обнаружен в дерме с помощью ВЭЖХ, что свидетельствует, по мнению авторов, об отсутствии необходимости рассмотрения

токсичности этого вещества при его поступления в системный кровоток через кровеносные сосуды кожи. На основании полученных данных в работе был сделан вывод, что фуллерен, включенный в липосомы, имеет обширный потенциал для безопасного использования в качестве компонента косметических средств для защиты от УФ-излучения. О сходных результатах сообщается в работе [173], где коллоидные наночастицы фуллерена С60 со средним размером около 43,8 нм проявляли антиоксидантную активность in vitro,сравнимую с водорастворимым витамином Е. Отсутствие смертности кератиноцитов эпидермиса человека наблюдали при концентрации фуллерена в 170 раз большей, чем ранее установленные величины LD50 фуллерена С60 для некоторых других клеточных линий человека. По мнению авторов, фуллерен С₆₀ нетоксичен, и ранее выявленные проявления его токсического действия объясняются эффектами со стороны применявшихся носителей (главным образом, органических растворителей).

Согласно работе [170]водорастворимые наночастицы гидроксилированного фуллерена (фуллеренол C60(OH)22-26) обладают одновременно цитотоксическим и фототоксическим действием на эпителиальные клетки хрусталика глаза человека (HLE B-3), причём эндогенный антиоксидант лютеин блокирует в некоторой степени эту фототоксичность. По мнению авторов в условиях in vivoвоздействие фуллеренола на глаз, особенно в присутствии солнечного света, может привести к повреждению сетчатки. В высоких дозах фуллеренол in vitroпроявлял цитотоксичекое действие в отношении клеток эндотелия человека [177]. И, напротив, авторы работы [102]наблюдали выраженное антиоксидантное действие в условиях ангиотензин-2-индуцированного оксидантого стресса на культуре клеток эндотелия пупочной вены человека для калиевой соли пентафенилфуллерена, образующей в воде мицеллярные растворы. Указанное соединение, по мнению авторов, может также быть эффектором процессов, связанных с высвобождением ангиотензина II. При оценке этих данных следует учитывать, что ангиотензин II это не просто физиологически активное вещество с гемодинамическим и почечным действием, а скорее биологически активный

посредник, который напрямую воздействует на эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов [65]. Этот пептид играет ключевую роль в инициации и усилении патофизиологических процессов, приводящих к сосудистым заболеваниям. Кроме того, ангиотензин II является главным медиатором окислительного стресса и снижает активность оксида азота путем активации НАДН/НАДФН-оксидазы, тем самым, генерируя супероксид-анион.

Фототоксичность для кератиноцитов человека фуллерена C60 в виде аддукта с у-циклодекстрином и фуллеренола C60(OH)24 была охарактеризована в сравнительном аспекте [188]с использованием модели оценки токсичности, индуцированной УФ и видимым светом. При этом было показано, что полигидроксилирование фуллерена сопровождается снижением токсического действия в 60 раз, несмотря на то, что обе формы наноструктур были способны генерировать супероксид и синглетный кислород под действием светового излучения. Применительно к фуллеренолу эти данные подтверждаются также работой [138], выполненной на эпителиальных клетках хрусталика человека. Фототоксичность фуллеренола опосредовалась продукцией синглетного кислорода; данный эффект ингибировался антиоксидантным каротиноидом лютеином. Хотя, как отмечают авторы, фототоксичность фуллеренола была низкой, его высокий тропизм к клеткам хрусталика и длительное пребывание в их составе могут привести in vivoк нежелательным последствиям.

Известно, что в зависимости от условий эксперимента, немодифицированный фуллерен C₆₀способен проявлять не только прооксидантные, но и антиоксидантные свойства [58]. В частности, авторами исследования [174]показано, что дисперсии фуллерена, стабилизированные полиэтиленгликолем, изостеаратаом, поливинилпирролидоном и γ- циклодекстрином, а также растворимый фуллеренол могут выступать в роли ловушки свободных радикалов супероксид-аниона и гидроксила. Полученные по указанной технологии фуллеренсодержащие препараты оказывали протективное действие на кератиноциты человека в отношении УФ-облучения [118, 63, 64].

В исследовании [78]в сравнительном аспекте охарактеризованы механизмы цитотоксичности фуллерена С_б0 и его полигидроксилированного производного фуллеренола в отношении различных клеточных культур: мышиных клеток фибросаркомы L929, крысиных клеток глиомы tC6, человеческих клеток глиомы U251. Цитотоксичность фуллерена была выше, чем у фуллеренола, на 3 порядка величины. С_б0 вызывал быстрый некроз (по механизму фотореактивного окисления) клеток без фрагментации ДНК, в то время как фуллеренол индуцировал апоптоз, фрагментацию ДНК, нарушения клеточной мембраны. Использование антиоксидантов (N-ацетилцистеина) приводило к нивелированию токсического эффекта фуллерена Сбо, но не фуллеренола, действие которого блокировал ингибитор каспазы. Можно предположить, что в отличие от фуллерена, для которого основным механизмом воздействия на клетки является фотоиндуцированная продукция свободных радикалов, гидроксилированное производное в высоких дозах оказывает, по-видимому, влияние на внутриклеточные молекулярные механизмы апоптоза, связанные с процессами ограниченного протеолиза, запускаемыми активацией каспаз.

Интересные результаты были получены в работе [184]. Авторы показали, что направленность биологического действия и возможная токсичность фуллеренола, связаны с его локальной концентрацией в месте его действия. Эти данные были получены в исследовании влияния различных концентраций фуллеренола на культивируемые нейроны гиппокампа крысы. При этом фуллеренол в зависимости от концентрации либо способствовал гибели клеток, либо защищал их от повреждения. Причина этого, по мнению авторов, состоит в том, что при высоких и при низких концентрациях фуллеренол по-разному действует на окислительно-восстановительные процессы в клетке.

Таким образом, результаты исследований цитотоксических свойств фуллеренов и их производных в системах in vitroпротиворечивы. Имеется достаточно большое количество работ, в которых фуллерены практически не проявляли цитотоксического действия, и не меньшее число исследований, показавших способность фуллеренов вызывать гибель клеток, оксидантный

стресс, апоптоз и другие нежелательные эффекты. В свете имеющихся данных о физико-химических свойствах фуллеренов и их производных, очевидно, что расхождение этих результатов обусловлено как условиями проведения опыта (вид клеточной линии, концентрация, способ введения, проведение эксперимента в темноте, либо при освещении), так и различиями в интерпретации данных, полученных на основе определения различающихся, часто не сопоставимых параметров.

При этом необходимо отметить, что возможность экстраполяции данных о токсичности для клеточных культур in vitroна условия in vivo,отвечающие естественному пути поступления токсикантов в организм (с пищей, водой, вдыхаемым воздухом, через неповрежденную кожу) вообще, как правило, затруднена при отсутствии надёжных данных о всасывании, биодоступности, биоаккумуляции, биотрансформации и кинетике выведения этих веществ из организма. В случае же фуллеренов и их производных при этом возникают и специфические трудности, связанные с разным характером их биологического действия в темноте и на свету, возможными немонотонными зависимостями выявляемых эффектов от концентрации, высокой реакционной способостью фуллеренов, неопределенностью в вопросе о составе и возможной биологической активности продуктов их метаболизации в организме.

2.3