Применение блокаторов ионотропных рецепторов при пентилентеразоловом киндлинге

Целью настоящей части работы было исследование морфологических изменений в нейронах гиппокампа мышей, возникающих в результате киндлинга, и возможной корреляции между способностью блокаторов глутаматных рецепторов NMDA-типа мемантина, ИЭМ-1921 и ИЭМ-1958, предупреждать как судорожные проявления киндлинга, так и сопутствующие морфологические изменения (Васильев и др., 2013).

Исследование возможной корреляции между судорожными проявлениями ПТЗ киндлинга и структурными изменениями нейронов гиппокампа было проведено на пяти группах мышей: (1) интактные мыши; (2) контрольные мыши, которым с целью развития киндлинга по стандартной схеме вводили ПТЗ; (3) мыши, которым вводились 0,3 мг/кг ИЭМ 1921 + ПТЗ; (4) мыши, которым вводились 1 мг/кг ИЭМ-1958 + ПТЗ и (5) мыши, которым вводились 0,5 мг/кг мемантина + ПТЗ.

Первое введение ПТЗ мышам контрольной группы не вызывало судорожных реакций. Лишь слабые подергивания кончиков ушей и вибрисс были отмечены у части животных. Начиная со второго введения, у единичных мышей (10-20% животных) возникали слабо выраженные и непродолжительные клонические судороги. По мере увеличения порядкового номера последовательных введений такой же дозы ПТЗ процент мышей, проявивших судорожные припадки, нарастал, достигая максимума (70%) к 11-12-ому введению (рис. 6). К концу эксперимента у 70% мышей контрольной группы наблюдались клонико-тонические судороги (ср. балл 3,9), а 30% мышей оказались устойчивыми к действию ПТЗ и не судорожили на протяжении всего опыта (ср. балл 0). Общий средний балл у мышей контрольной группы ПТЗ киндлинга составил 2,7.

У экспериментальной группы мышей, которым на протяжении месяца за 30 мин до стандартной подпороговой дозы ПТЗ вводили 0,3 мг/кг ИЭМ-1921, развитие киндлинга существенно замедлилось. У 14 из 20 мышей, взятых в опыт, судорожная реакция полностью отсутствовала после первых 7 введений ПТЗ и постепенно появлялась, начиная с 8-ого введения, устойчивый ПТЗ-киндлинг был достигнут лишь к концу эксперимента (12 введений ПТЗ + ИЭМ-1921). У 6 остальных мышей судорожные проявления отсутствовали до конца эксперимента. Средний балл ин-

Рис. 6. Влияние блокатора NMDA рецепторов ИЭМ-1921(0.3 мг/кг) на развитие ПТЗ киндлинга у мышей

По оси ординат - процент судорожавших животных в 2 группах из 10 животных каждая. По оси абсцисс - нумерация последовательных введений (3 раза в неделю 35 мг/кг ПТЗ, в/п ) - верхняя кривая (контроль); 35 мг/кг ПТЗ + 0,3 мг/кг ИЭМ-1921 (опыт)

тенсивности судорог в группе (ПТЗ+ИЭМ-1921) составил 0,7, т.е. в 3,9 раза ниже, чем в контрольной группе.

Используя аналогичную схему, было проведено исследование другого нового блокатора глутаматных рецепторов NMDA типа, ИЭМ-1958, производного адаман- тана. У 5 из 8 мышей этой серии ПТЗ киндлинг не развился до конца эксперимента. У остальных 3 мышей первые судорожные припадки силой 2-3 балла появились после 9-ого введения, т.е. профилактическое действие препарата оказалось весьма эффективным. Мемантин был использован в настоящем исследовании как препарат сравнения. При его введении в дозе 0,5 мг/кг у 5 мышей из 8 ПТЗ киндлинг не развился.

В контрольной группе животных киндлинг вызывал существенные структурные изменения пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа. Если у интактных животных в срезах гиппокампа было обнаружено только 0,15% гиперхромных нейронов (рис. 7а,б), то в контрольной группе мышей с выраженными проявлениями ПТЗ киндлинга (присутствие клонико-тонических судорог) были обнаружены выраженные патологические изменения (рис.

Рис. 7. Структурные изменения в нервной ткани поля СА1 гиппокампа у мышей, вызванные ПТЗ киндлингом. Масштаб 20 мкм

а - прямоугольником обозначен исследуемый участок поля СА1 гиппокампа, б - интактные мыши, нормальная структурная организация нейронов, в - в конце ПТЗ киндлинга. Стрелками показаны изменённые «по тёмному типу» сморщенные гиперхромные пирамидные нейроны с искривлёнными дендритными отростками, г - эффективное предупреждении развития ПТЗ киндлинга в присутствии 0,3 мг/кг ИЭМ-1921, д - то же, в присутствии 1 мг/кг ИЭМ-1958, е - то же, в присутствии 0,5 мг/кг мемантина

клеток принимала удлиненно-суженную форму. При исследовании подгруппы мышей, у которых несмотря на систематическое введение ПТЗ не развился типичный киндлинг, гиперхромные нейроны в срезах гиппокампа были единичны (2,3±2,3%) (см. рис. 7).

Морфологические различия между животными с выраженным киндлингом и устойчивыми к киндлингу были найдены и в экспериментальных группах мышей, которым вводили блокаторы NMDA рецепторов. В мозге животных, устойчивых к киндлингу, не было обнаружено каких-либо патологических изменений нейронов, тогда как у подверженных киндлингу животных гиперхромные нейроны присутствовали. При сравнении нейропротекторного действия различных препаратов у животных с выраженными судорогами было выявлено, что ИЭМ-1921 слабо предотвращал появление гиперхромных нейронов (24,0±5,6%), тогда как введение ИЭМ-1958 и мемантина существенно уменьшало их число (6,6±0,9% и 1,7%, соответственно).

Киндлинг является удобным экспериментальным приемом, поскольку постепенное нарастание патологического процесса дает возможность проследить последовательность и взаимосвязь его проявлений.

Совокупность полученных нами результатов свидетельствовала, что гиперхромные нейроны («темные клетки») появлялись в результате судорожных приступов, перенесенных животными в ходе развития ПТЗ киндлинга. Подобные изменения нейронов «по темному типу» обнаруживались при морфологическом анализе самых разнообразных патологических процессов в мозгу при ишемии (Jenkins et al., 1981; Kovesdi et al., 2007), гипогликемии (Auer et al., 1985a,b), эпилепсии (Sloviter, 1983), избыточном действии возбуждающих медиаторов (Sloviter, Dempster, 1985; Kherani, Auer, 2008). Однако существующие мнения о природе этого феномена и даже о его причинно-следственной связи с патологией конкретных нейронов неоднозначны. Часть исследователей даже расценивает появление темных клеток как артефакт, вызванный нарушением условий содержания и фиксации ткани (Jortner, 2006). Тем не менее, проведение надлежащих контролей и получение надежных в каждом отдельном случае признаков связи между гиперхромностью нейронов и патологическим воздействием позволяет использовать этот критерий при оценке интенсивности процесса.

Следующим убедительным аргументом в пользу такой связи можно считать способность трех блокаторов глутаматных рецепторов NMDA типа мемантина, ИЭМ-1921 и ИЭМ-1958 предупреждать развитие не только судорожного компонента ПТЗ-киндлинга, но и появление гиперхромных нейронов в гиппокампе. Молекулярный механизм взаимодействия использованных блокаторов с активируемыми глутаматом NMDA рецепторами подробно исследован (Bolshakov et al., 2000, 2003, 2005). Производные адамантана (мемантии и ИЭМ-1958) и фенилциклогексила (ИЭМ-1921) блокируют потенциалозависимым образом открытое состояние канала NMDA рецептора (Chen et al., 1992; Bolshakov et al., 2000, 2003, 2005; Тихонов, Магазаник, 2010), конкурируя при этом с ионами магния (Kotermanski, Johnson, 2009; Nikolaev et al., 2012).

Ранее нами было проведено сравнение противосудорожной активности мемантина и ИЭМ-1921 с использованием нескольких моделей в опытах на мышах: острые судорожные состояния, вызываемые внутрижелудочковым введением NMDA или каината (Лукомская и др., 2002), внутрибрюшинным введением ПТЗ (Лукомская и др., 2003), ареколина (Лукомская и др., 2007), ПТЗ киндилинг (Лукомская и др., 2005) и в опытах на крысах линии Крушинского-Молодкиной, генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам (Ватаев и др., 2009; Ким и др., 2012; Лукомская и др., 2012). В настоящем исследовании возможной корреляции между противосудорожным и нейропротекторным действием неконкурентных блокаторов NMDA рецепторов были использованы их равноэффективные дозы в диапазоне ЭД40-ЭД55.

Результаты проведенных экспериментов выявили эту корреляцию. В контрольной группе систематическое введение ПТЗ вызывало у 70% мышей состояние кин- длинга, что выражалось появлением судорожных ответов. При морфологическом исследовании срезов СА1 гиппокампа этих мышей обнаружено значительное число темных нейронов. Превентивное введение блокаторов NMDA рецепторов снижало долю мышей с развившимся ПТЗ киндлингом в среднем с 70% до 40%. Содержание измененных нейронов у 60% мышей экспериментальных групп, у которых ПТЗ киндлинг не развился и судороги не проявлялись, составило 0,1±0,06%, т.е. столько же, сколько в мозгу интактных мышей. Среди этих 60% могли быть и мыши, резистентные к действию ПТЗ изначально, а не вследствие профилактического действия блокаторов. Однако доля резистентных мышей в контрольной группе была в 2 раза меньше. Кроме того, появление судорожных припадков у опытных групп мышей по сравнению с контрольной было существенно задержано.

По поводу причинно-следственной связи между судорогами и феноменом темных нейронов существуют противоречивые данные. Прежде всего, появляются ли темные клетки в мозгу крыс после однократного введения дозы 70-80 мг/кг ПТЗ, вызвавшей судороги (Ahmed et al., 2005), либо темные клетки могут быть обнаружены только в результате повторных введений ПТЗ (Aniol et al., 2011), причем как при исследовании мозга животных с выраженными судорожными проявлениями, так и при их видимом отсутствии (Павлова и др., 2005). Согласно результатам настоящего исследования ПТЗ киндлинга у мышей, предшествующий судорожный синдром является непременным условием обнаружения темных клеток в гиппокампе. В основе расхождения данных могут лежать различия в объектах (крысы, мыши), оценке интенсивности судорог и критериев морфологических изменений.

Мало известно о дальнейшей судьбе темных клеток после возникновения в мозгу патологического очага, эти сведения необходимы для более полного понимания их природы (Gallyas et al., 2005; Ooigawa et al., 2006; Kherani, Auer, 2008). В последнее время появляются результаты комплексных исследований процессов дегенерации зрелых нейронов и пролиферации молодых нейронов в ростовых областях нервной ткани (Jiang et al., 2004; Park et al., 2006; Tian et al., 2009; Aniol et al., 2011; Danzer, 2012). Работа в этом направлении способна пролить свет на общую проблему клеточных механизмов эпилепсии. Требует также уточнения роль глутамата в последовательности процессов, приводящих к повреждениям мозговой ткани, вызванным судорожным синдромом, и, в частности, ограничивается ли она повышением входа ионов кальция в нейроны через открытые ионные каналы глутаматных рецепторов.

5.