Исследование субстратной специфичности анти-ОБМаутоантител на модельных пептидах

Дальнейшее исследование специфичности аутоантител мы проводили с помощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пептидов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной последовательности ОБМ (Belogurov et al., 2008; Бачева и др., 2011).

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов гидролиза фосфорилированного ³²P ОБМ специфичны- миаутоантителами, полученными от больных РС и модельных мышей линии SJLc индуцированным ЭАЭ, визуализированная с помощью авторадиографии

Представлены точки, соответствующие 2, 3, 4, 5 и 24 часам прохождения реакции. М - низкомолекулярный маркер. Адаптировано из (Ponomarenko et al., 2006)

Рис. 4. А - схема плазмидного вектора, сконструированного для экспрессии фьюжн-белка тио- редоксина E. coli c фрагментами ОБМ. Б - аминокислотная последовательность ОБМ человека. Показано распределение пептидов 1-12 на последовательности ОБМ. Адаптировано из (Ponomarenko et al., 2006)

подвижности конструируемым рекомбинантным белкам.

Для характеристики субстратной специфичности антител фьюжн-белки тиоре- доксина с фрагментами ОБМ инкубировали с иммуноглобулинами (суммарная IgG фракция), выделенными из сыворотки крови 26 больных РС, 22 пациентов с другими нейродегенеративными заболеваниями (other neurological diseases, OND), 11 здоровых доноров (healthy donors, HD) и мышей аутоиммунной линии SJL с ЭАЭ, индуцированным иммунизацией ОБМ (Belogurov et al., 2008). Как видно из приведенных электрофореграмм (рис. 5), в случае пациентов с РС и остеохондрозом (OND) протеолизу подвергались только пептиды, содержащие энцефалитогенную последовательность ОБМ. С другой стороны, у мышей SJL c ЭАЭ, предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, наблюдался множественный гидролиз перекрывающихся эпитопов ОБМ.

Каталитические свойства проявили антитела, изолированные из сывороток крови 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения РС. Среди больных нейродегенеративными заболеваниями и здоровых доноров доля положительного каталитического ответа была 9% и 0% соответственно (рис 6). Исключение составили два случая остеохондроза, при которых было отмечено наличие каталитической деградации пептида ОБМ под действием аутоантител. Причем эти больные характеризовались значительной длительностью патологического процесса и серьезными нейрональными поражениями. Расщепление рекомбинантных белков бычьим трипсином, катепсином D и металлопротеазой матрикса 3 (MMP-3) (см. рис. 5, нижняя часть) проводили как контроль на специфичность гидролиза. Для всех исследованных антител методом масспектрометрии SELDI сайты гидролиза были локализованы исключительно в рекомбинантных фрагментах ОБМ (рис. 7, табл. 4), белок-носитель и линкерная часть оставались интактными. Причем, в случае абзимов, выделенных из сыворотки крови мышей линии SJL, сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов повторяют таковые в нативном белке (см.

Рис. 5. Гидролиз эпитопной библиотеки аутоантителами и протеазами

Сверху вниз: контроль; гидролиз модельных пептидов протеолитическими антителами, полученными от пациента с РС, с остеохондрозом, аутоиммунных мышей линии SJL с ЭАЭ, индуцированным ОБМ; или же бычьим трипсином, катепсином D и металлопротеазой матрикса 3. Адаптировано из (Belogurov et al., 2008)

Рис. 6. Схематическое представление доли пациентов с различными формами РС (RR - ремитирующая, PP/SP - прогрессирующая), больных другими нейродегенеративными заболеваниями (OND), а также здоровых доноров, антитела которых проявляли каталитическую активность. Адаптировано из (Belogurov et al., 2008)

Рис.

ные пептиды (см. рис. 5). Сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов данными антителами (см. рис. 7) в целом аналогичны действию на них неспецифической протеазы, однако по сравнению с ограниченным трипсинолизом не распространяются на тиоредоксин и линкерную часть. Объяснением возникновения такого разнообразия ОБМ-специфичных протеолитических антител у мышей линии SJL при иммунизации основным белком миелина может служить уже упоминавшаяся ранее особенность данной модельной линии - крайнее высокая частота индукции клонов В-клеток, продуцирующих каталитические антитела. Сравнение сайтов расщепления рекомбинантных субстратов из сконструированной нами библиоте-

Сайты гидролиза модельных пептидов аутоантителами, выделенными из сывороток крови пациентов с PC, и протеолитическими ферментами

RR - ремиттирующий, PP - первично прогрессирующий, SP - вторично прогрессирующий тип РС; E - обострение, R - ремиссия, основные сайты отмечены светло-серым цветом, темно-серым показаны минорные.

ки под действием аутоантител и набора протеиназ, в том числе специфичных к ОБМ (см. рис. 5, 7, табл. 4), приводит к выводу о достаточно значительных отличиях в специфичности этих биокатализаторов (процессинг полноразмерного белка аналогичными биокатализаторами представлен в табл. 5). Этот факт позволил нам

Таблица 5

Сайты протеолиза основного белка миелина различными протеазами и каталитическими

антителами

Рис. 8. А - принципиальная схема FRET-подхода к исследованию кинетики абзиматической реакции. Б, В - расщепление белка EPeFRET абзимами и модельными протеазами соответственно.

Во врезке показано изменение спектра флуоресценции во времени. Адаптировано из (Belogurov et al., 2008)

поставить вопрос о «специфическом модельном субстрате» для возможного скринингового анализа сывороток больных РС и гибридом, продуцирующих моноклональные каталитические антитела к ОБМ.

На основании данных по «дифференциальной специфичности» по сравнению с расщеплением протеиназами для реакции с аутоантителами нами был выбран фрагмент 81-103, содержащий энцефалитогенную последовательность ОБМ, для интеграции во FRET-пару Для этого на основе вектораpQe30 была создана генно-инженерная конструкция, экспрессирующая два флуоресцентных белка PS- CFP2 и TurboYF, соединенные вышеуказанным пептидом ОБМ, так называемый «EPeFRET»-белок (рис. 8А). При разрезании линкера прекращается резонансный перенос энергии и происходит падение флуоресценции (рис. 8Б,В).

6.2.