Кинетические исследования гидролиза ОБМ и EPeFRET (ОБМ81-103)
Для определения кинетических констант гидролиза ОБМ специфичными иммуноглобулинами высокоочищенные антитела (IgG ОБМ+ фракция) инкубировали с ОБМ, а затем аликвоты реакционной смеси наносили на обращенно-фазовую колонку С4для определения степени гидролиза субстрата (Ponomarenko et al., 2006).
На основе полученных данных была построена полная кинетическая кривая, а соответствующие кинетические константы определены из графика в координатах Уокера-Шмидта (рис. 9). Каталитическая эффективность ккат/Кт составила 1.Е103 и 3.0^103 М-Ьс-1 в случае антител человека и мыши, соответственно (табл. 6). Данные величины более чем на два порядка ниже по сравнению с специфичными протеазами, например, энтерокиназой быка, эффективность которой по отношению к природному субстрату трипсиногену составляет 7.1-105 М-Ьс-1. В то же время, каталитическая эффективность изучаемых антител в большинстве случаев превосходит значения, продемонстрированные для ранее полученных абзимов. Можно предположить, что достаточно медленное, но направленное действие антител по протеолизу ОБМ, возможно, играет определенную роль в разрушении миелиновых структур и патогенезе РС.Кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантителами, трипсином и металлопротеазой матрикса - 3, а также ингибирование данной реакции слитными белками и препаратом Копаксон, известным лекарственным средством при РС (см. ниже), представляющем собой сополимер лизина, глутаминовой кислоты, аланина и тирозина, представлены в табл. 7 и на рис. 10 (Belogurov et al., 2008). Каталитическая эффективность изученных биокатализаторов уменьшалась примерно на порядок в ряду трипсин - MMP-3 - абзим. Интересно, что значение ккат/Ктреакции гидролиза полноразмерного белка и модельного субстрата EPeFRET в случае каталитических антител оказалось близким и различается в пределах ошибки.
Характер ингибирования расщепления EPeFRET слитными белками тиоредоксина с фрагментом ОБМ 81-103, его мутантом R97A, белком-носителем и Копаксоном радикально отличается в случае катализа абзимами и модельными протеазами. Если
Рис. 9. Полная кинетическая кривая гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (А)
На врезке данные представлены в координатах Уокера-Шмидта. Адаптировано из (Ponomarenko et al., 2006)
Таблица 6
Кинетические константы гидролиза ОБМ аутоантителами
| Пациент с РС SJL EAE | Km (M) | k (с L кат | k /K (с-1М-1) кат m |
| (7,0 ± 3,0) • 10-6 | (0,8 ± 0,2) • 10-2 | (1,1 ± 0,5) • 103 | |
| (4,0 ± 1,0) • 10-6 | (1,1 ± 0,3) • 10-2 | (3,0 ± 1,3) • 103 |
Таблица 7
Кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантителами и модельными протеазами, а также ингибирование данной реакции слитными белками и Копаксоном
| Тип био- катали затора | Кинетические константы гидролиза EPeFRET | Ингибирование реакции гидролиза EPeFRET (IC50, рМ) | |||||
| Km(pM) | k„ (с-1) | kit/Km (c-1 M-1) | ОБМ81-103 | ОБМ81-103 R97A | Тгх | Сорахопе | |
| Три псин | (3,5±0,4)-101 | 8,8±1,5 | (2,5±0,7)-105 | 3,1±0,7 | 1,8±0,6 | 2,9±0,3 | (2,0±0,1)-10-1 |
| ММР-3 | 6,4±0,8 | (2,4±1,0)-10-1 | (3,8±1,8)-104 | 8,2±0,8 | (1,2±0,1)-101 | (1,5±0,1)-101 | (2,0±0,1)-101 |
| Абзим | 7,6±0,9 | (1,4±0,2)Т0-2 | (1,8±0,5)-103 | (7,0±2,0)-10-3 | (9,0±1,0)-10-2 | Не действ. | (1,0±0,2)-10-1 |
536
Рис. 10.
Кривые ингибирования абзиматического и ферментативного гидролиза EPeFRET слитным белком Trx с фрагментом ОБМ81-ЮЗ (А), его мутантом R97A (Б), Копаксоном (В) и белком-носителем (E)Адаптировано из (Belogurov et al., 2008)
для каталитических антител способность к ингибированию в ряду Тгх-ОБМ81-103, Тга-ОБМ81-103^97А). Trx падает со значения IC50 7.0-10-3 до >100 мкМ, то для ферментов рассчитанные значения IC50 находятся в диапазоне от 3 до 20 мкМ независимо от типа ингибитора. Эффективное ингибирующее действие Копаксона на реакцию, катализируемую трипсином, по-видимому, объясняется высоким (до 29%) содержанием остатков лизина в этом сополимере.
С использованием тех же групп пациентов и здоровых доноров была проанализирована связывающая активность к ОБМ и к его эпитопной библиотеке поликлонального пула иммуноглобулинов из сыворотки крови. Уровни аутоантител к фрагментам ОБМ 48-70 и 85-170, а также к полноразмерным молекулам ОБМ и МОГ были достоверно выше в сыворотке крови пациентов с РС в сравнении со здоровыми донорами. Однако специфическое взаимодействие всего лишь с двумя короткими фрагментами ОБМ 43-68 и 146-170 достоверно различалось в паттерне связывания аутоантител при РС и других нейродегенеративных заболеваний (рис. 11). Данный факт еще раз свидетельствует о необходимости тонкого дифференциального подхода к диагностике РС по уровню антител и мимикрирующих под него нейродегенеративных заболеваний неаутоиммунной природы. Противоречивые данные относительно корреляции уровня антител к ОБМ и развития РС могут быть связаны именно с использованием полноразмерной молекулы ОБМ в качестве тестового антигена (Antel, Bar-Or, 2003; Berger et al., 2003; Kuhle et al., 2007b). Интересно, что корреляция уровня антител с EDSS (качественный параметр, характеризующий тяжесть заболевания) была установлена для несколько других фрагментов основного белка миелина 81-103 (r2=0.332; p=0.024), 130-156 (r2=0.381; p=0.011), 146-170 (r2=0.310; p=0.033) (рис. 12), что свидетельствует о разной значимости пептидов ОБМ в инициации и развитии заболевания (Belogurov et al., 2008).
Как уже упоминалось, в последнее десятилетие роль В-клеточного ответа и сопутствующего образования антител к собственным антигенам при различных аутоиммунных заболеваниях приобретает все большее значение. Нами на основе имеющейся выборки пациентов с нейрональными патологиями показано, что каталитическая активность аутоантител по отношению к ОБМ и его фрагментам выделяет РС в сравнении с другими нейродегенеративными заболеваниями значительно больше, чем их связывание с данным антигеном. Продемонстрированная сайт-специфичность каталитических антител в отношении ОБМ и его презентированных пептидов позволяет вплотную подойти к созданию тест-систем для диагностики и терапии РС на основе сконструированных модельных субстратов (Belogurov et al., 2008).
7.
Еще по теме Кинетические исследования гидролиза ОБМ и EPeFRET (ОБМ81-103):
- Рассеянный склероз: патогенез, диагностика и лечение
- Кинетические исследования гидролиза ОБМ и EPeFRET (ОБМ81-103)