1.2 Цитомегаловирусная инфекция: этиология, патогенез, диагностика, эпидемиология, профилактика

Возбудителем этой инфекции является цитомегаловирус человека (Cytomegalovirus Hominis) (ЦМВ) – условно-патогенный микроорганизм, относящийся к семейству герпесвирусов (Herpes virus), подсемейству В-герпесвирусов пятого типа; для него характерен узкий диапазон хозяев и длительный тип репликации (10,129,357).

Вирионы ЦМВ человека имеют диаметр около 200 нм и представляют собой двухтяжевые молекулы ДНК, заключенные в нуклеокапсид, окруженный тегументом, покрытым липопротеидной оболочкой. Определение внутренних протеинов имеет большое значение для ранней диагностики ЦМВИ (191,211,309,346). Геном цитомегаловируса человека самый крупный из всех геномов представителей семейства герпесвирусов. Репликация вируса происходит следующим образом. Вирус адсорбируется на клетке с помощью специфических рецепторов; проникает в цитоплазму, где происходит разрушение оболочки; оставшийся капсид продвигается в ядро. В ядре репликация вириона завершается полной сборкой, при выходе из клетки он одевается мембраной (98,113,158,309,334,335,336). Структуры, лишенные сердцевины вируса, не обладают инфекционными свойствами (226).

Вирус способен вызывать продуктивную, абортивную, а также латентную формы инфекции (199,206,335). Отдельные штаммы ЦМВ человека обладают онкогенными свойствами, приводя к малигнизации клеток (215,280).

Для этого вируса характерна строгая видовая специфичность (187). Вне организма он размножается в диплоидных эмбриональных кожно-мышечных и легочных клетках человека. Оптимальная PH среды 7,2 – 8,0. ЦМВ термолабилен: инактивируется при прогревании при 56⁰ С и хранится при +4⁰ С в течение недели, при медленном замораживании до -20⁰ С его инфекционность теряется.

Активность репродукции цитомегавируса зависит от ряда факторов: дозы вируса, путей заражения, возраста пациента, генетических особенностей и состояния иммунитета в момент заражения (10,113,115).

Репликация попавшего в кровь ЦМВ происходит в лейкоцитах и в системе мононуклеарных фагоцитов. Вирус персистирует в лимфоидных органах (188). В данном случае клетки не инактивируют вирус, а наоборот, являются элементами крови и лимфоидных органов, в которых он размножается, делая его недоступным для специфических циркулирующих антител и интерферона, что имеет существенное значение в патогенезе цитомегаловирусного заболевания. Многие вирусные частицы захватываются макрофагами и уничтожаются. Однако часть вирусных частиц, связанных с лейкоцитами, продолжает циркулировать в организме, обуславливая диссеминацию вируса (180,227,249,285).

Важную роль в патогенезе ЦМВИ играет система клеточного иммунитета (122,285). Только при иммунодефицитном состоянии больного ЦМВИ проявляется яркой клинической картиной (248). Причиной иммунной недостаточности могут быть различные факторы: физиологическая иммунная недостаточность детей раннего возраста, иммунодефицит, обусловленный беременностью, ятрогенными вмешательствами, неблагоприятными экологическими факторами (8,129).

ЦМВИ является одной из ведущих СПИД-ассоциированных инфекций. Она активизируется в В-стадии ВИЧ-инфекции, то есть в период острой инфекции со вторичными заболеваниями (51).

Свойства ЦМВИ, как оппортунистического заболевания, проявляются и в других ситуациях, когда в организме больного возникает Т-клеточный иммунодефицит. Подавление клеточного иммунитета человека может быть и следствием прямого воздействия цитомегаловируса на Т-лимфоциты (29,138,208,209).

Наиболее значительные изменения выявляются в субпопуляции хелперов / индукторов, уровни которых падают, в то же время уровни супрессоров / киллеров увеличиваются.

На фоне угнетения иммунного ответа цитомегаловирус током крови разносится в различные органы и системы и адсорбируется на клеточных мембранах эпителия, например слюнных желез (преимущественно околоушных), а вирионы проникают в цитоплазму, индуцируя цитомегалический метаморфоз клеток (ЦМК) и образование цитомегалов. ЦМВ может персистировать в организме человека пожизненно (20,129).

Однако имеются данные, свидетельствующие, что персистирующая ЦМВИ в большинстве случаев не сопровождается нарушениями в составе субпопуляции Т-лимфоцитов (хелперы/супрессоры), характерными для синдрома цитомегаловирусного мононуклеоза (283).

Хроническая ЦМВИ сопровождается выработкой различных антител (нейтрализующих, комплементсвязывающих, тормозящих гемагглютинацию, агрегацию тромбоцитов и др.), которые не препятствуют его репродукции в организме.

Таким образом, патогенез различных форм цитомегаловирусной инфекции еще недостаточно изучен. Однако достоверно установлено, что в ряде случаев заболевание развивается в результате активации латентной инфекции на фоне снижения резистентности организма, связанной с иммунодефицитным состоянием.

Цитомегаловирусная инфекция человека –является антропонозом, при котором источником инфекции является больной человек или хронический вирусоноситель. Источник наиболее опасен в активной фазе первичного инфицирования или в период обострения инфекции.

Механизмы передачи цитомегаолвируса могут быть различными: как естественные – аспирационный, фекально-оральный, прямой так и непрямой контактный, вертикальный; искусственный (артифициальный).

Пути передачи ЦМВ могут быть: воздушно-капельный, половой, контактно, пероральный, парэнтеральный и энтеральный (93,129,135,136,154, 275,302).

Факторами передачи являются: кровь, цервикальный и вагинальный секреты, сперма, женское молоко, слюна.

Входными воротами для ЦМВ человека в антенатальном и интранатальном периодах может быть плацента и плодные оболочки, в неонатальном и любом возрасте – дыхательные пути, пищеварительный тракт, а также возможно заражение через кровь.

Данные о периодичности и сезонности ЦМВИ пока отсутствуют.

Цитомегаловирусная инфекция не имеет выраженной цикличности. Инкубационный период и продромы могут пройти стерто в виде острого респираторного заболевания, состояния утомления и слабости. Даже в разгар заболевания может наблюдаться симптоматическое многообразие, что создает большие сложности при клинической диагностике. Для этой инфекции характерно длительное вирусоносительство, иногда хроническое, что, как мы предполагаем, можно объяснить латентной формой вируса, то есть присутствием вируса внутри «нормальной» клетки, по аналогии с онкогенными вирусами, тем более, что отдельные штаммы цитомегаловируса также обладают онкогенными свойствами (18,280).

Латентное носительство вируса приводит к инаппарантной форме течения патологического процесса. В активной форме цитомегаловирус человека способен преодолевать плацентарный барьер и поражать плод в любые сроки беременности, вызывая нарушения, характерные для врожденной инфекции (38,121,126,128,186,316,323).

Наибольшая опасность для плода возникает при первичном заражении женщины, не защищенной специфическими антителами, в первые 20 недель беременности (122,123,124). Американскими авторами установлено, что ежегодно рождались около 0,1% (3-4 тыс.) новорожденных с признаками ЦМВИ, тогда как у 1,0% (30-40 тыс.) инфекция протекала бессимптомно, однако, у 15% из них имелись в дальнейшем осложнения со стороны органов слуха, зрения и ЦНС (161,192,279,297).

В более поздней работе Smith Т.F. (1994) уже было показано, что около 0,2-2,4% всех рожденных детей в США инфицированы ЦМВ. Признаки и симптомы ЦМВИ выявлялись у 5-10% новорожденных с врожденной инфекцией. Смертность новорожденных с клиническими проявлениями ЦМВИ достигала 30%, а у выживших в 90% случаев отмечались неврологические последствия, которые однако могли наблюдаться и у 10% инфицированных детей, не имевших клинических проявлений. У 90-95% детей врожденная ЦМВИ протекала бессимптомно, при этом мог отмечаться более низкий вес при рождении по сравнению с неинфицированными новорожденными (269,329).

В работах последних лет, проведенных отечественными исследователями, в России выявлено 2,3-3,7% новорожденных с внутриутробной ЦМВИ (38,64,67); с помощью ПЦР выявляли внутриутробную ЦМВИ и в более высоких значениях (34).

Инфицирование в ранние сроки беременности вызывает выкидыш, рождение мертвого плода и острую врожденную инфекцию (58,65).

Установлено, что первичная ЦМВИ встречается у 0,7-6,8% беременных женщин. В 24-50% эти случаи завершаются рождением детей с врожденной ЦМВИ, при этом у большинства младенцев она носит бессимптомный характер (10,89,119,124,188,189,259,303).

Обследование детей с врожденной ЦМВИ выявило у них нарушение гуморального и клеточного иммунитета (29). Было показано, что у этих детей отмечается длительное выделение ЦМВ и низкие уровни специфических антител. У большинства детей выделение вируса из слюны регистрировали в течение 2 лет, а из мочи в течение 5 лет (330).

Трансплацентарная передача цитомегаловируса плоду наиболее убедительно подтверждается выявлением антител класса IgM непосредственно из сыворотки крови пупочного канатика (69, 331).

Рядом авторов было показано, что антитела класса IgМ могут быть выявлены у 1 – 1,7% здоровых новорожденных, подтверждая таким образом острую бессимптомную ЦМВИ (76,254).

Русанова Н.Н. с коллегами показали, что частота выявления IgМ-антител против ЦМВ у новорожденных изменяется с возрастом от 34% в 3 месяца, достигая максимума в 4 месяца (61%) и снижаясь к 4% в 6 месяцев (55).

Определение у здоровых новорожденных (1%) антител к ЦМВ класса IgG свидетельствует о возможной передаче через плаценту не только ЦМВ, но и материнских IgG антител, в отличие IgМ, которые вырабатываются самим плодом. Реактивация хронической ЦМВИ в первой половине беременности является причиной рождения детей с выраженными симптомами болезни. Doerr Н.W. с соавторами наблюдали клинические проявления ЦМВИ у 10-50% инфицированных новорожденных. Врожденная генерализованная ЦМВИ может завершиться летальным исходом (154, 230), либо поражением головного мозга с разнообразными психоневрологическими дефектами развития в дальнейшем (271,341).

Инфицирование во второй половине беременности приводит к хронической врожденной инфекции, выражающейся в поражениях ЦНС, печени, потере слуха и нарушении зрения (118,119,163,220,345). Беременные, у которых вирус находится в латентном состоянии, могут родить детей с инапарантной, либо умеренно выраженной ЦМВИ, а клинические проявления инфекции обнаруживаются в более поздние сроки (до 2 лет) (318). При условии напряженного иммунитета у ребенка первичное инфицирование ЦМВ может привести к латентной инфекции на протяжении всей его жизни.

Однако у беременных с латентной ЦМВИ плод поражается не всегда, а преимущественно на фоне физиологической иммунодепрессии, либо при заболевании матери другой инфекцией, когда имеет место проникновение ЦМВ в кровь.

Часто ЦМВ является причиной бесплодия; ряд авторов показали, что у женщин, страдающих подобным недугом, в 19,2% выявляются специфические антитела класса IgM (254).

Постнатальное заражение новорожденного протекает, как правило, бессимптомно. Инфицирование новорожденного может иметь место при прохождении через родовые пути матери. Как показано рядом авторов, от 12,5 до 26% детей заражались в процессе родов, причем вирус выделялся у них до 3 месяцев (258, 259). Другим, достаточно часто встречающимся путем заражения новорожденных является вскармливание грудным молоком женщины-вирусоносителя (360). В работах Stagno S. с соавторами и Hayes К. c соавторами выявлено, что у 58% детей, вскормленных молоком матерей, выделявших ЦМВ, развилась цитомегалия, тогда как среди искусственно вскормленных проверенным молоком, заболевших ЦМВИ не наблюдалось (97,136). Инфекция чаще протекала в субклинической форме, так как дети с материнским молоком получали секреторные иммуноглобулины IgA и IgM. На более поздних сроках, когда здоровые дети начинают ходить и посещают детские центры, ясли или сады, они могут контактным путем заразиться от детей с бессимптомной ЦМВИ. В середине 80-х годов в США и Европе были проведены широкие исследования в детских дневных центрах; ЦМВ был изолирован с игрушек и рук; было показано, что он сохраняется на них в течение 30 минут (164,225,231).

Schupfer P.C. с соавторами выделяли ЦМВ из слюны, попавшей на поверхности предметов, в течение 2 часов, а из бумажных пеленок в течение 48 часов (319). Подобные исследования других ученых из Швеции, Канады, США подтвердили эти результаты (77,78,120,121,132,133,171,231). Дети, посещающие детские учреждения, являются источниками инфекции в семьях. Как было выявлено рядом исследователей, 25-80% детей заражаются ЦМВ в детских учреждениях и длительно выделяют его с мочой и слюной, по данным Taber L.H. с соавторами, как минимум 9 месяцев (75). Такие дети могут инфицировать родителей и медицинский персонал. Было показано, что в семьях циркулируют те же штаммы ЦМВ, что и в детских учреждениях, посещаемых обследованными детьми (77,79). Заражение происходит при тесном бытовом контакте (170).

Таким образом могут формироваться множественные очаги инфекции, как в детских учреждениях, так и семейные очаги.

Случайный контакт не всегда может быть причиной передачи вируса. Тем не менее возможно инфицирование человека при прямом контакте – при поцелуе, фактором передачи в этом случае является слюна, в этой связи ЦМВИ ранее называли «болезнью поцелуев». Имеются данные об оральном и воздушно-капельном путях заражения.

Среди взрослого населения ЦМВ передается, в основном, половым и парентеральным путем. Уровень инфицированности населения цитомегаловирусом очень высок; еще в начале 70-х – середине 80-х годов в индустриально развитых странах он колебался от 56 до 83% (80,106,131,357). В странах третьего мира он был выше – 90 -100%. Серологическое обследование женщин Лимы, Перу выявило 89,1% сероположительных к ЦМВ (90, 322). На Кубе из 220 беременных женщин 1,08% имелись свежие IgM антитела против ЦМВ, а у новорожденных они были выявлены у 0,8% (86). Обследование беременных женщин Мадагаскара в возрасте 17-30 лет показало серораспространенность ЦМВ в 83% случаев (165).

В России в Омске и Омской области было обследовано 6486 жителей и выявлено, что 76,1% мужчин были серопозитивными к ЦМВ; у женщин IgG антитела к ЦМВ выявлены в 82,2%. В среднем среди городского населения ЦМВ-антитела класса IgG определялись чаще (78,0%), чем среди сельского (70%). Авторы предполагают, что эта разница связана с большей активностью распространения вируса за счет более высокой плотности населения и большей доли лиц с нарушением иммунной системы (14).

Ряд исследователей констатируют прямую зависимость между социально-экономическим уровнем жизни населения и уровнем заболеваемости ЦМВИ. Среди населения с низким уровнем жизни 40-60% лиц инфицируются в возрасте до 5 лет, к 15-19 годам специфические антитела выявляют­ся в 50-88% (14,137,142,143,299).

По данным зарубежных и отечественных исследователей у 3,5-20% практически здоровых женщин из канала шейки матки был выделен ЦМВ;

примерно у 30% здоровых мужчин в сперме выявляется вирус цитомегалии.

Выдумкиной С.П. и соавторами были исследованы сыворотки 1312 детей разного возраста и 250 взрослых и показано, что у детей до 1 года антитела к ЦМВ класса IgМ встречаются в 1,3% случаев, но в течение года их процент возрастает до 5. 5-6% детей дошкольного и школьного возраста имеют эти ранние вирусспецифические антитела. У взрослых частота показателя острой инфекции достигает 15% (9).

В работах зарубежных авторов показано, что частота выявления антител IgМ увеличивается с 15% до 63% с возрастом от 20 лет до 60 лет и более соответственно (122,218,262,315).

Многими исследователями показано, что среди лиц, ведущих беспорядочную половую жизнь – проституток, гомосексуалистов и других, - очень высокий процент лиц, имеющих как бессимптомную, так и активную формы ЦМВИ (156,157,300,343). Было выявлено, что среди гомосексуалистов 90% имеют IgM антитела, указывающие на «свежую» инфекцию, а также у 36% можно было выделить ЦМВ из спермы и мочи (131).

В другом исследовании, проведенном учеными Швейцарии, было показано, что среди 150 гомосексуалистов у 74% были выявлены специфические антитела к ЦМВ. Интересно упомянуть, что у инъекционных наркоманов сероположительные в отношении ЦМВ лица составляли 31% (298).

Для России приведенные выше данные актуальны. За последние 5 лет количество лиц, потребляющих наркотики возросло в 3,5 раза и в настоящее время колеблется от 3 до 4 млн. человек. Около 100 тысяч молодых людей состоит на учете наркологической службе МЗ РФ, более 150 тысяч –на учете в системе МВД РФ. Увеличивается число молодых женщин, употребляющих наркотики; за последние 10 лет их число возросло в 10 раз. Среди проституток 25% используют инъекционные наркотики (27,35,36).

Способность цитомегаловируса сохраняться в лейкоцитах приводит с одной стороны к возможности развития ЦМВИ у реципиентов органов, крови и ее компонентов, с другой – к длительному латентному состоянию этой инфекции и проявлению ее активности на фоне лечения цитостатиками и иммунодепрессантами (74,109,130,229).

В работе Courault K. и соавторов из 3458 обследованных доноров у 56,3% были выявлены специфические иммуноглобулины к ЦМВ (125).

Wreghitt Tim описал наблюдение с января 1970 года по март 1988 года за 244 пациентами (217 мужчин и 27 женщин) в госпитале Papworth, которым трансплантировали сердце и легкие. У 17,6% из них была выявлена первичная ЦМВ-инфекция, а у 31,1% – реактивация или реинфекция ЦМВ. Более тяжело заболевание протекало при инфицировании через донорский орган нежели через кровь или ее продукты (248,359).

Показано, что пересадка почки и переливание крови от сероположительного к ЦМВ донора к серонегативному реципиенту приводили к заболеванию цитомегаловирусной инфекцией, тогда как пересадка почки от серонегативного донора к серонегативному реципиенту не приводило к ЦМВ-заболеванию (301,332).

Sarov Z. и соавторы обнаружили возвратную ЦМВИ у больных с пересаженной почкой. Из 15 пациентов в сыворотках 14 были выявлены вирусспецифические антитела класса IgA против ЦМВ в интервале от 1 до 12 недель после трансплантации, через 6 –12 недель у 6 пациентов были обнаружены антитела класса IgM и 11 больных в промежутке от 3,5 дней до 32 недель из мочи выделяли цитомегаловирус (147).

Цитомегаловирусная инфекция занимает одно из первых мест в структуре вторичных оппортунистических заболеваний у больных ВИЧ-инфекцией (7,214,228,273). Поражение Т-клеточной защиты, связанное с ВИЧ-инфекцией, допускает реактивацию латентного ЦМВ с последующей виремией и рассеиванием вируса по всем органам (138).

Так Rook R.с соавторами при обследовании органов больных, погибших от ВИЧ-инфекции, в 10 из 17 органов выявили и идентифицировали ЦМВ-инфекцию. Цитомегалические клетки были обнаружены в легких, надпочечниках, кишечнике, ЦНС, печени и пищеводе (153).

Первичная ЦМВИ часто поражает больных СПИДом. У 79% таких больных развивается симптоматическая, прогрессирующая ЦМВ-инфекция, приводящая к различным нарушениям: слепоте, слабоумию и другой неврологической патологии. Развивается ЦМВ-пневмония, почечная недостаточность, неукротимый понос, первичные и вторичные системные васкулиты и другие проявления (60,70).

Цитомегаловирус обладает онкогенными потенциями: его выделяли из опухолей больных саркомой Капоши (181), из злокачественной лимфомы (312), карциномы простаты (197,215). ЦМВ был изолирован из рака шейки матки, аденокарциномы толстой кишки и идентифицирован в вирусологических исследованиях в пермиссивных клеточных культурах (194,270,350).

Приведенные данные подтверждают возможную этиологическую роль ЦМВИ в возникновении онкологических заболеваний человека.

Диагностика ЦМВИ, основанная на клинической картине, при многообразии проявлений, крайне затруднена. Многие десятилетия диагноз «цитомегалия» ставился посмертно на основании патанатомического обнаружения цитомегалических клеток (ЦМК). Только в 1952 году был впервые поставлен прижизненный диагноз с помощью морфологического исследования осадка мочи ребенка и выявления в нем ЦМК (173).

Работы Smith M. G., позволившие идентифицировать ЦМВ человека в электронном микроскопе и в дальнейшем реплицировать его в пермиссивных культурах клеток фибробластов эмбрионального миометрия, открыли путь к дальнейшим разработкам лабораторных диагностических методов (255,327).

Лабораторные методы стали включать три вида исследований: морфологические, культуральные и серологические (244,245,246). Морфологические методы выявляли с помощью цитологического окрашивания гемотоксилином и эозином или азур-эозином ЦМК в слюне, моче, глоточных смывах, спинномозговой жидкости и т.п. пациентов (54,66,82).

Культуральные методы заключались в подсеве 3 дневной культуры лейкоцитов больного к выросшим в пробирках на покровных стеклах пермиссивным кожно-мышечным или легочным эмбриональным клеткам человека. Полученные пробирки с лейкоцитарными культурами и фибробластами периодически встряхивали и часть культуральной жидкости с попавшими в нее лейкоцитами переносили в другие пробирки с пермиссивными клеточными культурами. Покровные стекла с лейкоцитарными культурами фиксировали метиловым или этиловым спиртом и окрашивали гематоксилином и эозином или Азур III-эозином по Романовскому (65,227,344).

Серологические методы, основанные на выявлении специфических антител и сероконверсии в крови пациентов, включали реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию нейтрализации (РН), реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) и агрегации тромбоцитов (193,207,210,287).

Позже спектр диагностических методов был расширен и усовершенствован, методы стали более специфичными и чувствительными. Лабораторная диагностика стала основываться на различных методах выделения цитомегаловируса, его антигенов, специфических антител, характерных морфологических изменениях, идентификации вирусной ДНК.

Для разработки новых качественных тест-систем необходимо было получить большие количества антигена цитомегаловируса.

В 1980 году нами (Каражас Н.В., Канторович Р.А., Хилько С.Н. и др.) был впервые разработан метод получения специфического антигена ЦМВ с преобладанием белков с молекулярным весом 10 – 60 KDа и общим содержанием белка 1,36 мг/мл защищенный авторским свидетельством № 9713117.

В 1988 году в США был запатентован способ выделения ЦМВ из культуры клеток, зараженной цитомегаловирусом, и его использование для обнаружения антител против ЦМВ. Антиген выделяли из зараженных клеток культуры крайней плоти человека в присутствии гипертонического раствора (2-3,5 М) неорганических или органических солей (KCl, гуанидин HCl, MgCl, NaCl и т.д.). Экстракцию вируса проводили при температуре не выше 30⁰ , РН 6 –10 (178).

Классическим и наиболее убедительным до сих пор является метод выделения ЦМВ из материалов больных в культуре клеток.

Так Paradis Irvin с соавторами исследовали образцы смывов клеток легких иммунодефицитных лиц, страдающих цитомегаловирусной пневмонией, на наличие ЦМВ. Вирус был изолирован в культуре клеток у 100% больных ЦМВ-пневмонией и у 70% больных пневмонии другой этиологии. С помощью цитологического обследования ЦМВ-включения были обнаружены только у 21% больных ЦМВ-пневмонией.

Эти исследования демонстрируют значительно большую чувствительность вирусологического метода (306).

Однако выделение вируса на клеточных культурах требует обычно нескольких недель наблюдения. Рядом исследователей были предприняты усовершенствования метода для быстрого обнаружения цитомегаловируса в материалах больных.

Crawford Stephen с соавторами нашли, что возможно повышение чувствительности, специфичности и быстроты получения результатов при использовании метода, основанного на подсеве вируссодержащего материала во флаконы с культурами клеток на покровных стеклах, затем центрифугируемых на малых скоростях для оптимизации адсорбции ЦМВ на клетках (307).

Значительно ускоряет получение результатов при диагностике острой ЦМВ-инфекции применение высокочувствительного метода обнаружения прераннего и раннего белков с помощью непрямого иммунофлюоресцентного метода с использованием моноклональных антител. Этот метод позволяет обнаружить ранний антиген ЦМВ в материалах больного (моче, слюне и др.) уже через 16 – 24 часа после внесения его в культуру клеток (177,224,266,305). Сравнительный анализ методов выделения вируса с использованием низкоскоростного центрифугирования при адсорбции на клетках, определения прераннего белка (р72 КД) через 16 – 20 часов после инфицирования культуры клеток (РИФ) и определения вирусной ДНК методом гибридизации через 5 дней после инфицирования клеток показал, что наиболее чувствительным оказался метод выявления вирусной ДНК (93,0%), у 51,4% был обнаружен вирусный преранний белок и в 32% случаев установлена репликация ЦМВ по цитопатическому действию (13,100, ,208,311,342).

Цитомегаловирусная персистирующая инфекция не проявляется клинически, в органах и тканях отсутствуют симптомы воспаления, не наблюдается цитопатическое действие вируса при внесении его на чувствительные культуры из-за малой инфекционной дозы. Тем не менее в инфицированных клетках с помощью ДНК гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявляется присутствие вирусной ДНК (111, 144). Только при появлении в организме условий, при которых инфицированная клетка вновь станет пермиссивной, инициируется продуктивная инфекция и будет наблюдаться репликация ЦМВ (183).

Полимеразная цепная реакция – высокочувствительный метод, однако, иногда может осуществляться амплификация ЦМВ-ДНК, полученной из лейкоцитов периферической крови бессимптомных ЦМВ-позитивных пациентов с латентной ЦМВ-инфекцией, и даже ЦМВ-отрицательных лиц. Дальнейшая разработка количественного метода ПЦР, а также подбор праймеров к сверхранним, ранним и поздним генам, обеспечит ведущую роль этого метода в диагностике цитомегаловирусной инфекции человека (143).

Наши соотечественники из Санкт-Петербурга Виноградская Г.Р., Попов С.Д. и др. использовали ПЦР для диагностики ЦМВИ у новорожденных и у детей раннего возраста, для изучения этой инфекции на секционном материале. Они показали, что ПЦР обладает высокой чувствительностью и рекомендовали этот метод для использования в диагностически неясных случаях, в том числе для дифференциальной диагностики с инфекциями, вызванными другими ДНК-содержащими вирусами (20, 45).

При невозможности применения методов выделения вируса или определения вирусных ДНК и РНК, а также в дополнение к ним значительная роль отводится серологическим методам диагностики. Большое значение имеет серодиагностика в эпидемиологических исследованиях.

Современные серологические исследования, помимо РСК, непрямой иммунофлюоресценции, реакции подавления гемагглютинации, латекс-агглютинации, радиоиммунологического анализа, включают фермент-связанный иммуносорбентный метод (ELISA-ИФА), Вестерн-блотт и антитело-захватывающий ELISA (162,217,274).

Все эти методы позволяют выявлять в исследуемых сыворотках крови антитела классов IgA, IgM и IgG.

В середине 80-х годов, когда создавались новые серологические тест-системы для детекции специфических антител против ЦМВ, были проведены работы по сравнению чувствительности и специфичности отдельных серологических методов. Сравнение РНГА и ИФА показало, что оба метода пригодны для выявления специфических антител, однако, ИФА обладал преимуществами и поэтому был рекомендован для скрининга сывороток доноров на наличие антител к ЦМВ (105).

При сравнении РСК, латексагглютинации, качественного ИФА с антигеном на шариках и количественного ИФА на планшетах наиболее чувствительными были признаны методы латексагглютинации и ИФА на шариках, тогда как специфичными – РСК и ИФА на планшетах. Сероконверсия выявлялась всеми количественными методами (127).

Другие исследователи, сравнивая метод латексагглютинации и РИФ, (АВВОТТ) нашли, что обе эти тест системы в 100% выявляют антитела к ЦМВ. Специфичность методов РИФ (АВВОТТ) и латексагглютинации (в пределах 96,4% - 92,2 %). Авторы для скрининга рекомендовали как наиболее простой и быстрый метод латексагглютинации (167).

Дальнейшие работы по сравнению ИФА и РИФ показывали высокую чувствительность обоих методов; у одних авторов 100% чувствительность и специфичность была отмечена в ИФА (320), у других наибольшей чувствительностью обладал РИФ, но этот метод давал большее количество ложно положительных результатов (310).

В настоящее время для эпидемиологических исследований цитомегаловирусной инфекции отдается предпочтение ИФА. Теперь уже эти тест-системы разработаны и у нас в стране (52), производятся рядом отечественных предприятий.

Серологические исследования позволяют выявлять специфические антитела к ЦМВ класса IgG, реагирующие с целым вирусом, клеточными ранними и поздними белками и отдельными регуляторными и структур­ными гликопротеинами. Сероконверсия антител класса IgG у больных или выздоравливающих говорит о первичной инфекции, повышенные титры указывают на реинфекцию, либо на реактивацию латентного ЦМВ.

Выявление антител к ЦМВ, реагирующих с ранними белками (IgM), может помочь различить активную и латентную фазы инфекции. Так, например, определение ЦМВ-специфических антител класса IgМ выявило у 73% беременных женщин первичную ЦМВИ, а у 98,8% больных мононуклеозом и у новорожденных (в 50-69%) - врожденную ЦМВИ (63,104,112,217,274).

Используя адекватные серологические методы можно проводить эпи­демиологические исследования по изучению иммуноструктуры населения,

в том числе, выявлять соотношение восприимчивых и невосприимчивых к ЦМВ лиц и тенденции к изменению этого соотношения.

Определение иммуноструктуры населения, раннее выявление вирусо-носителей и групп риска может стать основой для разработки тактики профилактических мер в отношении ЦМВИ.

Уже многие годы делаются попытки получить вакцину против цито-мегаловируса человека. Трудность подбора штамма для приготовления вакцины заключается в опасности вызвать болезнь у здоровых людей, в наличии антигенных вариантов среди различных штаммов ЦМВ человека, а также способность этого вируса к малигнизации клеток.

Во Франции были испытаны две вакцины из аттенуированных штаммов ЦМВ. Штамм АД 169, аттенуированный в процессе 54 – 58 пассажей в клет­ках человеческого происхождения, предназначался для орального, внутрикожного и подкожного применения. При подкожном введении не наблюдалось экскреции вируса, тем не менее у вакцинированных появ­лялись специфические антитела, персистировавшие в течение года. Штамм Towne 125, аттенуированный в ходе 125 пассажей в клет­ках wi-38 с сепарацией клонов, был изучен более детально. ЦМВ-вакцину использовали для иммунизации здоровых взрослых добровольцев, женщин детородного возраста, больных перед почечной трансплантацией, а также в комбинации с краснушной вакциной. У вакцинированных сформировались антитела 2 – 3-й неделе после вакцинации, пика они достигли к 4 – 8-ой неделям и сохранялись в титре 1:10 более 12 месяцев. Вакцинация обоими штаммами сопровождалась появлением умеренных местных реакций. Однако, несмотря на развитие антител после вакцинации у 7 из 17 трансплантированных больных обнаружилась цитомегаловирусная инфекция. Видимо, титр ЦМВ-специфических антител был недостаточен для защиты вакцинированных пациентов (108).

В США Plotkin S. и соавторы также разработали несколько вариантов вакцин (живых и инактивированных) (81,288).

Позже начались разработки вакцин на основе белков цитомегаловируса.

Методом двухмерного электрофореза в ПААГ в клетках, инфицированных ЦМВ человека, обнаружили синтез 35 новых белков, у 13 из которых была одинаковая молекулярная масса между 28000 и 47000 КDа. Высокоразрешающая жидкостная хроматография этих белков с последующим электрофорезом в ПААГ свидетельствовали о возможности их разделения и получения в чистом виде. Многие из полученных фракций связывались со специфическими антителами и вызывали пролиферацию лимфоцитов крови только от иммунных доноров.

В дальнейшем для создания эффективной субъединичной вакцины против ЦМВИ человека требовалось определить локализацию вирусных антигенов в клетках (мембрана, цитоплазма, ядро) и в вирионах (мембрана, матрикс, нуклеокапсид), а также время экспрессии этих антигенов в клетках и роль в формировании иммунитета (88).

Позже другими американскими исследователями была запатентована вакцина против цитомегаловируса человека. Эта вакцина включает полипептиды, обладающие перекрестной иммунологической активностью с gPA ЦМВ. Они индуцируют у человека синтез нейтрализующих антител после иммунизации. Для получения полипептидов gPA ЦМВ используют изоляцию gPA из клеток, зараженных ЦМВ, путем экскреции его неионным детергентом с последующей адсорбцией на иммунно-аффинной колонке. Полученный gPA представляет собой смесь различных родственных форм полипептидов с разной степенью гликозилирования с различными электрофоретическими свойствами.

Созданная таким образом вакцина используется в смеси с адъювантами. Она предназначена для лиц с иммунодефицитами, женщин детородного возраста для подавления трансмиссии ЦМВ плоду, а также для больных, имеющих показания к трансплантации органов (264).

Таким образом, на основании анализа вышеизложенных данных можно сделать заключение о том, что эпидемиологические закономерности двух ОИ –пневмоцистоза и ЦМВИ пока изучены не полностью, сведения о них в разных странах различаются, методы исследования иммунного ответа организма человека на возбудителей этих инфекций весьма разнообразны.

Единые методические стандартные (унифицированные) подходы для изучения этих вопросов пока отсутствуют.

Несомненно, что судить о распространении этих ОИ, о поражении определенных возрастных, половых, профессиональных групп возможно только на основании результатов иммунологических (серологических) исследований с использованием адекватных диагностических тест-систем, ввиду трудности клинической дифференциальной диагностики. На момент начала наших исследований такие тест-системы в России практически отсутствовали, поэтому для выполнения эпидемиологических исследований прежде всего необходимо было разработать современные чувствительные и специфичные препараты, что и явилось одной из задач настоящей работы.