2.1. Исследование экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.

Изменение уровня экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина мы изучали с использованием двух методов: блот-гибридизации РНК и амплификации кДНК, полученной обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Изучение уровня мРНК вЗА-адаптина в образцах нормы и опухоли шейки матки мы проводили на препаратах тотальной РНК. Всего с помощью блот-гибридизации мы исследовали пятнадцать случаев рака шейки матки. И только в одном образце (номер 289) мы обнаружили заметное снижение количества мРНК вЗА-адаптина в опухоли по сравнению с нормой (рис. 16А). Небольшая частота снижения уровня мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях по сравнению с нормой может быть связана с тем, что, с одной стороны, это действительно редкое событие, а с другой - с убиквитарной экспрессией гена (Dell'Angelica et al. 1997) и присутствием в образцах

опухоли и нормы стромальных элементов (фибробластов, клеток крови и кровеносных сосудов) и возможной контаминацией нормальными клетками опухоли и наоборот.

Рисунок 16. Анализ экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина. А. Уровень мРНК в образце рака шейки матки. Верхний ряд - результат гибридизации тотальной РНК радиоактивномеченным зондом к первому экзону гена. Нижний ряд - фотография агарозного геля с тотальной РНК после электрофореза. Н - РНК из нормального эпителия; О - РНК из опухоли шейки матки одной и той же больной.

В связи с этим, мы исследовали изменение количества мРНК гена вЗА-адаптина в клеточных линиях рака шейки матки HeLa и SiHa после обработки их деметилирующим агентом 5-азацитидином с помощью ОТ-ПЦР и блот-гибридизации. 5-азацитидин является ингибитором ДНК-метилтрансферазы 1, которая осуществляет в клетке поддерживающие метилирование. При ее инактивации, происходит репликативно-зависимое деметилирование ДНК, включая и аберрантно-метилированные CpG островки. До недавнего времени было общепризнано, что таким способом возможно добиться восстановления экспрессии мРНК гена, если она подавляется за счет метилирования ДНК. Сравнение уровня мРНК мы проводили в необработанных и обработанных клетках одной и той же культуры. Результаты типичного опыта, полученные при применении ОТ-ПЦР, представлены на рисунке 16Б. Видно, что в клетках HeLa после обработки 5-азацитидином происходит реактивация транскрипции гена вЗА­адаптина. В клетках SiHa увеличение уровня мРНК происходило в два раза. Исследование методом Нозерн-блоттинга подтвердило эти результаты (данные не представлены). Таким образом, мы установили, что при обработке клеток рака шейки матки HeLa и SiHa деметилирующим агентом происходит реактивация экспрессии гена /ЗА-адаптина. На основании этих опытов можно сделать вывод о том, что экспрессия мРНК /ЗА-адаптина существенно снижена, по крайней мере, в клетках HeLa и может быть активирована деметилирующим агентом.