6. Бисульфитная модификация ДНК.
Данный метод основан на способности иона гидросульфита, получающегося при растворении бисульфита натрия в воде, взаимодействовать с цитозином в составе одноцепочечной ДНК с превращением последнего в урацил.
В тоже время 5-метилцитозин при тех же условиях модификации не подвергается. В дальнейшем производится амплификация исследуемой последовательности ДНК с помощью ПЦР. При этом все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин (Olek et al. 1996).200 нг геномной ДНК выдерживали 5 мин в кипящей водяной бане, после чего охлаждали во льду. Добавляли раствор NaOH до конечной концентрации 0,3 М и инкубировали при 50оС 15 мин. Затем вносили 2 объема 2% низкоплавкой агарозы ("Sigma", США) и всю смесь переносили в пробирку с холодным минеральным маслом для формирования агарозной " бусины". После этого добавляли раствор Na2S2O3 и гидрохинона до конечной концентрации 3.1 М и 0.5 мМ соответственно и инкубировали при
о Х
50 С 16 ч. Дальше промывали раствором 1 TAE 6 раз по 15 мин. Вслед за тем проводили десульфонацию раствором 0,2 М NaOH 2 раза по 15 мин и промывали первоначально раствором 1 TAE 1 раз 15 мин, а потом бидистиллированой водой 3 раза по 15 мин. Дальше «бусину» разводили нагреванием бидистиллированой водой в 10 раз и аликвоту использовали для
ПЦР.
Еще по теме 6. Бисульфитная модификация ДНК.:
- Исследование уровня тревожности матерей по Спилбергеру в модификации Ю.Л. Ханина и оценки матерями своих детей (экспертная оценка) по Дембо-Рубинштейн в модификации А.М. Прихожан, интерпретация результатов.
- Модификация МКЛ
- Химические модификации альфа-синуклеина
- Репликация ДНК
- 5. Рестрикция геномной ДНК.
- Строение и функции ДНК
- Распространение метилирования ДНК.
- Направленное клонирование фрагмента ДНК
- 10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.
- 13. Переосаждение ДНК (РНК).
- Нарушение механизмов репарации ДНК
- 4. Выделение ДНК из лейкоцитов.
- 11.1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану.
- 10. ДНК – материальная субстанция наследственности.