Методика проведения магнитно-резонансной (воксель-базированной)морфометрии

В качестве исходных данных использовались полученные при сканировании головного мозга Т1-взвешенные МРТ-изображения (MPRAGE), с толщиной среза

1 мм и изотропным вокселем. Дальнейшая обработка полученных данных

состояла из 3 стадий.

А

Б

Рисунок 2.4. Визуализация данных межгруппового анализа: А – 3D- изображения, Б – аксиальные срезы.

А Б

Рисунок 2.5. МР-морфометрия, аксиальная проекция: А – маска лобных долей, Б – маска височных долей.

Также в качестве зон интереса были отобраны области головного мозга, в которых, по результатам предшествующего исследования методом фМРТ, у больных с посттравматическим, а также дизрегуляторным и амнестическим вариантами УКН выявлены статистически достоверные различия активаций между периодами «активность-фон» по отношению к группе лиц, не имеющих когнитивных нарушений. Всего было обследовано 48 образований и областей

головного мозга (Таблица 2.5). Полученные результаты заносили в электронную базу данных для дальнейшего статистического анализа. Таким образом, был выполнен двухэтапный анализ результатов полученных данных.

Таблица 2.5 Области головного мозга, отобранные для исследования методом

МР-морфометрии

Методы определения концентрации синапсина 1 и синтаксина 1А в парных пробах ликвора и сыворотки крови

В выборку были отобраны 44 пациента находившиеся на стационарном

лечении в клинике нервных болезней Военно-медицинской академии.

Исследование проводилось на базе лаборатория микробиологии ФГБУ

«Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» СЗО РАМН совместно со старшим научным сотрудником лаборатории доктором биологических наук Шипицыной Е.В. Методом иммуноферментного анализа (ИФА, англ. – enzyme-linked immunosorbent assay) было выполнено определение концентрации нейрональноспецифических белков синапсина 1 (Synapsin-1, SYN1) и синтаксина 1А (Syntaxin 1A, STX1A) в парных пробах ликвора и сыворотки крови. В работе использовались коммерческие наборы фирмы Cusabio Biotech Co. Ltd. (Китай), предназначенные для определения специфических человеческих антител к SYN1 и STX1A в биологических средах. При проведении люмбальной пункции пробы ликвора в количестве 2 мл помещались в одноразовые стерильные пробирки, которые хранились в холодильной камере при температуре около

-35Сº. Непосредственно перед этим посредством пункции вены в области локтевой ямки производился забор 4 мл цельной крови в специальную одноразовую стерильную пробирку, предназначенную для центрифугирования.

Затем производилось ее центрифугирование в течение 15 минут при 1000 оборотах в секунду при температуре 4Сº. Далее полученную сыворотку переносили в одноразовые стерильные пробирки и сохраняли в холодильной камере также при температуре около -35Сº.

Проведение ИФА включало в себя несколько этапов.

1. Приготовление реагентов. Все реагенты доводили до комнатной температуры (18-25°C) в течение 30 мин. Концентрат конъюгированных с биотином антител к исследуемому белку (STX1A или SYN1) разводили в 100 раз, используя 10 мкл конъюгата и 990 мкл буфера для разведения конъюгата. Аналогичным образом готовили рабочее разведение пероксидазы хрена, конъюгированной с авидином. Для приготовления рабочего разведения промывочного буфера использовали 20 мл концентрата буфера и 480 мл дистилированной воды.

2. Приготовление стандартов. Для каждого анализа готовили свежие разведения стандартов. Перед использованием пробирку с лиофилизированным стандартом центрифугировали при 6000-10000 оборотах в минуту в течение 30 с. В пробирку со стандартом вносили 1 мл реагента для разведения образцов, получая раствор с концентрацией 1000 пг/мл для STX1A и 8000 пг/мл для SYN1, перемешивали до полного растворения и инкубировали при комнатной температуре, время от времени осторожно потряхивая пробирку. Затем готовили серию стандартов с концентрациями 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,2 и 15,6 пг/мл

для STX1A и 8000, 4000, 2000, 1000, 500, 250 и 125 пг/мл для SYN1,

последовательно перенося 250 мкл концентрированного стандарта в пробирки, содержащие 250 мкл реагента для разведения образцов. Содержимое пробирок тщательно перемешивали пипетированием перед переносом в следующую пробирку. В качестве стандарта с концентрацией 0 пг/мл использовали реагент для разведения образцов, в качестве стандарта с максимальной концентрацией (1000 пг/мл для STX1A и 8000 пг/мл для SYN1) – неразведенный стандарт (Рисунок 2.6).

А

Б

Рисунок 2.6.

3. Проведение анализа. Перед тестированием все образцы оттаивали и центрифугировали. В лунки планшета, покрытого антителами к STX1A, вносили по 100 мкл стандартов и образцов. Планшеты накрывали пленкой и инкубировали при 37°C в течение 2 часов, после чего удаляли жидкость (лунки при этом не промывали). Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл конъюгированных с биотином антител к исследуемому белку (STX1A или SYN1). Планшеты накрывали пленкой и инкубировали при 37°C в течение 1 часа, после чего жидкость удаляли и промывали лунки 3 раза, добавляя в них 200 мкл промывочного буфера, выдерживая 2 минуты и затем удаляя жидкость. После последней отмывки для полного удаления отмывочного буфера планшеты переворачивали и постукивали о чистые бумажные полотенца. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора пероксидазы хрена, конъюгированной с авидином. Планшет накрывали пленкой и инкубировали при 37°C в течение 1 часа, затем промывали 5 раз как описано выше. В конце реакции в каждую лунку добавляли по 90 мкл хромогенного субстрата (3,3’,5,5’-тетраметилбензидина, TMB), инкубировали при 37°C в течение 15-30 минут в темном месте, после чего реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента и

слегка постукивая по планшету для перемешивания. Оптическую плотность определяли при длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра Sunrise Tecan, Австрия.

4. Оценка полученных результатов. Расчет концентраций производился на основании калибровочной кривой, построенной по данным оптической плотности образцов стандартных разведений установленных при постановке реакции. Математические вычисления выполняли в программе CurveExpert 1.4 (Microsoft Corporation), рекомендованной для ИФА исследований. После этого, цифровые значения концентраций белков заносили в электронные таблицы для дальнейшего статистического анализа.