Цитологические и культуральные методы диагностики Malassezia-инфекций

Для получения достоверных результатов как при цитологическом, так и при культуральном исследовании, существенную роль играет способ отбора патологического материала. Известно несколько процедур, используемых для этих целей как в медицинской, так и в ветеринарной практике.

Метод прямого мазка-отпечатка очевидно является наиболее простым и доступным. Обезжиренное предметное стекло прикладывают на определен­ное время к очагу поражения, после чего препарат используют для цитологи­ческого исследования. Этот метод рекомендуется для применения в повсе­дневной ветеринарной практике [77].

Метод с использованием полосок полимерной пленки («пленочный ме­тод») был предложен впервые J. Wilkier в 1988 году. При этом методе полос­ку пленки площадью 1 см² дважды прикладывают к пораженному участку, после чего окрашивают для цитологического исследования, или помещают на поверхность питательной среды для культурального анализа. D. Morris [129] для отбра проб с гладкой кожи использовали полоски целлофана (5x2 см), которые прикладывали к поверхности кожи 2 раза, а затем помещали на поверхность среды Сабуро в каплю оливкового масла. Модификацией данно­го метода является метод с использованием липкой ленты (скотча). Данный метод применялся в частности A. Nell [96], D. Preziozi [146], М. Pechere [138].

Метод с использованием контактных чашек («бакпечаток») использу­ется в исследованиях R. Bond [34], A. Nell [96], A. Gupta [89]. Небольшие пластиковые чашки, заполненные до краев плотной питательной средой, прикладывают на определенное время к очагу поражения, после чего закры­вают крышкой и инкубируют. Данный метод позволяет провести количест­венный учет численности популяции дрожжей на определенной площади кожи. Помимо удобства в применении, он также является перспективным с точки зрения стандартизации диагностических процедур, т.к. «бакпечатки»

выпускаются промышленным способом.

Метод смыва существует в нескольких вариациях, в частности смыв- соскоб (по Williamson-Kligman) и смыв-мазок. В обеих случаях используется трафарет (кольцо), ограничивающий участок кожи определенной площади, который заполняется смывной жидкостью, после чего материал с поверхно­сти кожи отбирается посредством соскоба или мазка ватным тампоном. При сравнительном изучении обеих вариантов N. Keyworth [100] пришел к выво­ду, что они обладают практически одинаковой чувствительностью, однако метод «смыв-мазок» менее травматичен. Метод позволяет довольно точно определить плотность популяции дрожжей на участке кожи определенной

площади, широко распространен в медицинской микологии, однако мало­применим в ветеринарной практике.

R. Bond [34] для смыва использовал различные составы - Тритон X- 100, Твин-40, Твин-80, и пришли к выводу, что они одинаково подходят для получения суспензии дрожжевых клеток, однако жизнеспособность Malassezia spp. в суспензии существенно снижается уже через два часа. Чув­ствительность метода смыва была сопоставима с методом контактных чашек.

Отбор материала ватным тампоном-зондом является одним из наиболее распространенных методов отбора материала для культуральных и цитоло­гических исследований [56, 20,65]. Основное его преимущество - возмож­ность отбора проб из труднодоступных участков тела животного - межпаль­цевых складок, слухового канала; шерстный покров не препятствует отбору. Некоторые авторы при отборе материала из слухового канала используют специальный стерильный конус, через который вводят тампон-зонд в слухо­вой канал, что позволяет снизить контаминацию пробы микроорганизмами с ушной раковины [76].

При использовании большинства техник отбора патологического мате­риала пробы в дальнейшем могут быть использованы как для цитологическо­го, так и для культурального исследования. Исключение составляют метод прямого мазка-отпечатка, который используется только при цитологических исследованиях, и метод контактных чашек, применимый только для культу­ральной диагностики.

Среди авторов не существует единого мнения о предпочтительности ка­кого-либо из перечисленных методов отбора патологического материала. R. Kennis [97] провел сравнительное изучение эффективности нескольких диаг­ностических методов: отбор материала с помощью скотча с последующим культуральным анализом; отбор материала методом соскоба, отбор материа­ла ватным тампоном, и метод прямого мазка-отпечатка с последующим ци­тологическим исследованием. Установлено, что наибольшую чувствитель­

ность проявил культуральный метод с использованием скотча. Цитологиче­ское исследование оказалось менее чувствительным, причем метод отбора материала для исследования не оказывал существенного влияния на резуль­таты.

По мнению N. McEwan [124] оптимальными методами отбора материа­ла являются метод с использованием липкой ленты и метод вычесывания шерсти зубной щеткой по МакКензи (MacKenzie).

A. Omodo-Eluk [135] сообщает, что при отборе материала ватным там­поном дрожжи рода Malassezia были обнаружены на коже у 53% собак при культуральном исследовании и у 32% - при цитологическом. При отборе ма­териала с помощью липкой ленты эти показатели составили 80% и 43% соот­ветственно. Автор отмечают преимущества отбора материала с помощью скотча и культурального метода исследования по сравнению с цитологиче­ским.

Пробы, отобранные для культурального исследования, необходимо доставлять в лабораторию в максимально сжатые сроки. F. Bernardo [29] де­лал высевы материала с ватных тампонов-зондов не позднее 2 часов после отбора.

Резюмируя вышеизложенное, отметим положительные и отрицательные стороны различных методов отбора патматериала для диагностических ис­следований на наличие ТИа/ягоег/а-инфекций. Кожный соскоб связан с трав­мированием кожи и не позволяет точно оценить плотность популяции Malassezia spp. в очаге поражения. Метод смыва наоборот пригоден для оценки плотности популяции на определенной площади кожного покрова, однако он требует выстригания шерсти и не пригоден для труднодоступных участков тела.

Очевидно, наибольшей универсальностью обладает метод с использо­ванием ватных тампонов-зондов. Они пригодны как для отбора материала с гладкой кожи, так и из слухового прохода, межпальцевых пространств, кож­ных складок. Использование промышленно изготавливаемых стерильных ватных тампонов-зондов позволяет стандартизовать процедуру диагностики Мя/лул^ш-инфекций, что обеспечит получение достоверных воспроизводи­мых результатов.

Вопрос условий транспортировки патматериала для последующей куль­туральной диагностики к сожалению весьма поверхностно освещен в дос­тупной литературе. Исходя из общемикологической практики, патматериал (за исключением волос и кожных чешуек) должен быть исследован в течение часа после доставки или через 3 часа при хранении в холодильнике при +4°С [1]. Однако, в повседневой лабораторной парктике не всегда удется соблюсти эти условия.

В жидких образцах, полученных методом смыва с применением различ­ных детергентов, жизнеспособность Malassezia spp. резко снижается уже че­рез 2-3 часа. Сухие образцы (на пленке, на ватных тампонах-зондах, соскобы) также должны исследоваться как можно скорее, т.к. низкая влажность губи­тельна для дрожжевых грибов. Использование для транспортировки жидких питательных сред напротив создает предпосылки для размножения как дрожжей, так и сопутствующей бактериальной и грибной микрофлоры. Та­ким образом, эти способы не обеспечивают длительную сохранность в мате­риале грибов рода Malassezia, что ограничивает их использование в повсе­дневной ветеринарной практике.

В подавляющем большинстве изученных нами литературных источни­ков не упоминается об использовании микробиологических транспортных сред, которые бы обеспечивали длительную сохранность Malassezia spp. в образце патологического материала.

ture Swab^tm Transport media, однако авторы не расшифровывают состав транспортной среды, а также сроки, в течение которых клетки Malassezia spp. оставались жизнеспособными.

Приведенные данные указывают на актуальность дальнейших изысканий практичных и доступных методов отбора и транспортировки патологическо­го материала при диагностике ТИа/бШ'ег/а-инфекций.

Цитологическое исследование при диагностике Мд/д^л’ег/д-иифекций обычно включает фиксацию препарата над пламенем, его окраску и микро­скопию как в сухой, так и в иммерсионной системе микроскопа.

Для обнаружения клеток Malassezia может быть использовано несколько методов окраски. A. Kligman [102] для выявления Malassezia spp. и других патогенных грибов использовали окраску по Хотчкинсу-МакМанусу (Hotch- kins-McManus), известную также как метод с реагентом Шиффа. Данный ме­тод достаточно трудоемок и требует большого количества реагентов, однако он высокочувствителен и позволяет легко обнаруживать в тканях большин­ство видов патогенных грибов, в т.ч. образующих капсулу.

Окраска метиленовым синим и окраска чернилами Паркера (Parker ink) также используется для детекции грибов рода Malassezia. По данным L. Xiong [171], частота обнаружения Malassezia spp. при использовании этих методов существенно не отличается и составляет 96% при окраске метилено­вым синим и 94% при окраске чернилами Паркера. Однако окраска метиле­новым синим, в отличии от окраски чернилами, достаточно чувствительна и для обнаружения других дрожжевых грибов, в частности Candida spp.

М. Crespo [56] в своих исследованиях применяли окраску по Грамму. А. Padilha-Goncalves [136] успешно использовал окраску лактофеноловым си­ним.

Большинство зарубежных авторов используют окраску Diff-Quik, яв­ляющуюся модифицированным методом Райта (Wright), и выпускаемую промышленным способом (Dade Behring, Deerfield, IL, USA; Baxter Diagnos­

tics AG, Dudingen, Switzerland).

L. Comegliani [53] рекомендует окраску кристалл-виолетом. По данным авторов, при этом методе дрожжевые клетки окрашиваются интенсивно и практически моментально, а чувствительность метода сопоставима с таковой при использовании Diff-Quik.

Микроскопию проводят при увеличении хЮОО в иммерсионной системе или в сухой системе при увеличении х400.

Для оценки численности популяции грибов рода Malassezia не сущест­вует стандартных общепринятых показателей. Так, D. Perrine отмечает, что диагностическое значение имеет обнаружение в препарате даже одной дрожжевой клетки. R. Rosychuk [154] считает, что в норме при микроскопии с иммерсией должны обнаруживаться лишь случайные, единичные клетки.

По мнению F. Rausch [150], диагностическое значение имеет только обнаружение более 10 дрожжевых клеток в поле зрения при х400, что соот­ветствует примерно 4 клеткам при микроскопии с иммерсией. Аналогичный критерий использовал G. Fernandes [76]. По данным этого автора, у 33,3% здоровых и 30,2% больных отитом собак клетки Malassezia spp. не обнару­живались; у 40,0% здоровых и 28,3% больных собак содержание клеток не превышало 4 в поле зрения при микроскопии с иммерсией, и у 26,6% здоро­вых и 41,5% больных животных обнаружено более 4 клеток.

С. Reme сообщает, что в слуховом канале здоровых собак количество клеток Malassezia при микроскопии с иммерсией только в 4% превышало 4 клетки в поле зрения. У 50% животных этот показатель составлял 01,-1,3 клетки, у 28% дрожжи не обнаруживались, у 18% животных обнаруживали 1,5-3,5 клеток. На основании полученных результатов автор предполагает,

что в норме обнаружение клеток Malassezia не должно превышать 3,5 клетки в поле зрения при микроскопии с иммерсией (xlOOO) или 10 клеток при уве­личении х400.

Foster А. [77] считает популяцию дрожжей повышенной, если наблюда­ется 5 и более клеток в поле зрения при х400. Такого же мнения придержи­ваются J. Angus [17], J. Beck et al. [25].

D. Morris et al. [129] считают максимально допустимым количеством 1 клетку в мазках с кожи и 5 клеток в мазках из ушного канала в одном поле зрения при микроскопии с иммерсией.

М. Crespo et al. [56] сообщают, что количество дрожжевых клеток в пробах от собак, больных отитом, при увеличении 400х составляло в 43,8% менее 10 клеток в поле зрения; в 24,6% - более 10 клеток.

Р. Ginel et al. [22] приводят данные о корреляции интенсивности кли­нических признаков отита с численностью популяции дрожжей в очаге по­ражения. У больных собак обнаруживали 5 и более дрожжевых клеток в поле зрения при х400, у больных кошек - 12 и более клеток. При этом только у 2-х из 37 здоровых собак было обнаружено более 5 клеток в поле зрения. У 23 из 32 здоровых кошек клетки Malassezia spp. обнаружить не удалось.

J. Beck et al. [25] у собак с гнойным отитом обнаруживали в среднем 12 клеток в поле зрения при х400, у собак с эритематозным и эруминозным оти­том - 13 клеток, у собак с церуминозным отитом - 9, у собак к эритематоз­ным отитом - 2 клетки.

Таким образом, среди авторов нет единого мнения, какое содержание клеток Malassezia на кожном покрове считать нормальным или повышен­ным. Кроме того, при цитологическом исследовании содержание дрожжевых клеток в разных полях зрения в одном и том же препарате может существен­но колебаться, что снижает репрезентативность получаемых данных.

Гистологические методы диагностики Мз/а^ег/а-инфекций в клиниче­ской практике используются существенно реже. Как правило, при изготовле­

нии препарата большая часть дрожжевых клеток теряется, что искажает ре­зультаты исследования. D. Pin [139] для окрашивания гистосрезов использо­вал гематоксилин-эозин и сафранин, что позволяло обнаружить почкующие­ся дрожжевые клетки.

По сравнению с цитологическими, культуральные методы позволяют более точно оценить численность популяции дрожжей в очаге поражения, однако нет единого мнения, какую численность популяции считать патоло­гической. К сожалению, сравнительной оценке плотности популяции Malassezia spp. у здоровых и больных животных культуральными методами посвящены единичные публикации. Так, С. Cafarcia et al. [45] сообщают, что у собак, больных отитом, плотность популяции Malassezia spp. в слуховом канале составляла 66,0 КОЕ в образце, у кошек — 59,6 КОЕ. По данным R. Bond [39], на коже здоровых собак в области паха и подкрыльцовой ямки плотность популяции Malassezia spp. составляет менее 1 КОЕ на см².

Мнения различных авторов расходятся в оценке чувствительности и специфичности цитологических и культуральных методов. D. Morris [128] считает цитологический метод диагностики наиболее практичным и доста­точно информативным для повседневной ветеринарной практики. По данным М. Crespo et al. [56], частота обнаружения грибов рода Malassezia была иден­тичной при цитологическом и культуральном анализе, и составила в обеих случаях 68,4%. В другом исследовании частота обнаружения Malassezia-spp. культуральным методом составила 21,2%, цитологическим — 15,1% [58].

По данным A. Kumar et al. [103], частота обнаружения Malassezia spp. у здоровых собак составила 39,4% при цитологическом анализе и 45,4% - при культуральном. Однако у больных животных дрожжи обнаруживались с одинаковой частотой (82,1%) и при цитологическом, и при культуральном методе исследования.

Bensignor Е. et al. [52] при сравнительном изучении цитологического ме­тода с использованием липкой ленты и культурального метода контактных

чашек со средой Диксона пришли к выводу, что чувствительность культу­рального метода существенно выше, однако для оценки плотности популя­ции Malassezia spp. лучше подходит цитологический метод.

С. Cafarchia et al. [46] сообщают о бесспорном преимуществе культу­рального метода диагностики и предлагают использовать его в качестве «зо­лотого стандарта». По представленным данным, цитологический метод про­явил высокую специфичность (95%), однако крайне низкую чувст­вительность (лишь 30%).

J. Angus [17] считает наиболее достоверным комбинированное приме­нение цитологического и культурального исследования.

Резюмируя сведения о различных диагностических методах при Л/я/огсе^/я-инфекциях можно сделать вывод, что большинством авторов от­дается предпочтение культуральным методам диагностики. Они несколько более трудоемкие, нежели цитологические, однако обладают более высокой чувствительностью, позволяют провести видовую идентификацию изолята и определить его чувствительность к антифунгальным препаратам. Последнее обстоятельство имеет большое практическое значение, т.к. чувствительность грибов рода Malassezia к различным антифунгальным препаратам может су­щественно варьировать [88].

1.6.