Использование индивидуальных дейтерированных белков и нуклеиновых кислот в научных исследованиях
Большие возможности дает использование высокодейтерированных белков при изучении их организации и функционирования. Много методов разработано специально для изучения структурных особенностей этих макромолекул.
В ранних работах по этой проблематике использовали, естественно, белки тех организмов, которые хорошо росли на тяжеловодных средах, например — белки микроводорослей. Так, для сравнительного исследования протонированного и полностью дейтерированного образцов ферредоксина, их выделяли из клеток водоросли Synechococcus lividus, выросших на Н2О- и Б2О-средах. Исследования проводили с применением таких высокоточных методов, как электронный парамагнитный резонанс, электрон-ядерный двойной резонанс, протон-магнитный резонанс, Моссбауэр-спектроскопия, измерение температурозависимой магни- точувствительности. В ходе работы была более точно подтверждена модель структуры активного центра ферредоксина S. lividus, содержащего два атома железа — подобно тому, что предварительно было показано для ферредоксина шпината.Из аналогичных образцов биомассы этой микроводоросли выделяли для исследования протонированный и дейтерированный цитохром с. Сопоставляли спектры Раман-резонанса, которые были получены для окисленной и восстановленной формы белка при 441,6 нм, чтобы выявить индивидуальный пик резонанса сдвига гема при замене протия на дейтерий. Сравнение полученных спектров со спектром цитохрома с из миокарда лошади выявило довольно точное совпадение. Было отмечено, что некоторые сдвиги, наблюдавшиеся на спектрах дейтеро-гема цитохрома с S. lividus, превышают соответствующие сдвиги для частично дейтерированых металл опорфиринов.
Энзимологические исследования с использованием дейтерированных соединений или собственно белков не теряют своей актуальности. Так, недавно проведено исследование фосфорилирования,
катализируемого Са2+-зависимой АТФ-азой саркоплазматического ретикулюма.
Изучали возможности фермента, в том числе дейтериро- ванного, использовать в качестве индукторов Р3-1 -(2-нитро) фенилэтил-аденозин-5'-трифосфата и [К-18О3]-АТФ. Поскольку в спектрах дейтерированного фермента не обнаружены пики, характерные для внешних амидов второго рода, был сделан вывод, что конформационные изменения, связанные с фосфорилированием, происходят после связывания с АТФ. Кроме того, а- и/или р-фосфаты. связанной молекулы АТФ становятся частично дегидрированными при этом связывании. Авторы предположили, что Са2+-сайт АТФ-азы не подвергается изменениям при фосфорилировании.
Рис. 1. Принципиальная схема метода Isotope Coded Affinity Tags (ICAT).
Особого внимания заслуживает предложенная недавно методика определения содержания в биопробах интересующего исследователя белка, основанная на использовании дейтерированного зонда. Подобные эксперименты крайне важны, поскольку дают возможность точно определять уровень синтеза конкретного белка в тех или иных клетках. Метод получил название Isotope Coded Affinity Tags (ICAT).
Для сравнения концентрации конкретного белка в исследуемой и контрольной пробе используются парные зонды, имеющие по три функциональных участка. Первый участок каждого зонда отвечает за его связывание с цистеиновыми аминокислотными остатками белков в исследуемых пробах. Второй участок — биотиновая аффинная метка. Третий функциональный участок отличается у пары зондов: в одном из двух зондов этот участок содержит тяжелую метку — 8 атомов дейтерия (—8D. см. рис 1). Для определения содержания целевого белка в исследуемой пробе в нее добавляют избыток немеченого зонда ( 0D). В контрольную пробу вносят
8D тяжелый зонд в известной концентрации. Пробы смешивают и подвергают ферментативному гидролизу белка трипсином или Lys-C. Полученную смесь пептидов наносят на хроматографическую колонку с авидином для удержания фрагментов, связанных с аффинной биотино- вой меткой зондов.
Данная процедура позволяет удалить из смеси пептидов большую часть (немеченные зондами фрагменты), что существенно облегчает последующий анализ пробы. Пептиды, удержанные на аффинной колонке, смываются и подвергаются анализу с применением капиллярного жидкостного хроматографа (LC) в тандеме с масс-спектрометром (MS). На полученных MS-спектрах только целевой белок будет обнаруживать симметричные пики, отличающиеся на 8 Да. Оценив величину пиков можно определить содержание целевого белка в исследованной пробе.Можно отметить, что за последние годы применение данного метода получило значительное распространение, и позволило существенно упростить ряд протеомных исследований.
Наряду с разработками методов получения и использования дейтерированных белков и других стабильно меченных БАВ, пригодных для тех или иных исследований, продолжается совершенствование приборного и программного обеспечения для научных целей. Так, опубликована информация о разработке многоквантовой версии экспериментов HBHA(CBCACO)NH для изучения частично дейтерированных биомолекул. Метод основан на существенном снижении уровней релаксации протонов и углеродных атомов как следствие многоквантовой задержки в высокодейтерированных белках. Предлагаемая схема была проверена на выделенном из клеток Е. coli интерлейкине человека ПА, имеющем уровень содержания дейтерия 75 %. Авторы отмечают, что новая версия программы позволяет увеличить чувствительность в отношении этого гомодимерного белка примерно на 46 % .
По мере развития расширения использования методов генетической и белковой инженерии становится все более актуальным определение конформационных изменений не только белков, но и фрагментов молекул нуклеиновых кислот. Дейтерирование объекта помогает и в этих случаях. Так, применение компьютерной программы «Uppsala NMR-window» позволило установить конформацию 21-членной шпильки молекулы РНК
5'-r(A GCCCGCCUAAUGAGCGGGC U)-3'
даже при условии неполной ее дейтерированности.
4.3.
Еще по теме Использование индивидуальных дейтерированных белков и нуклеиновых кислот в научных исследованиях:
- Применение низкомолекулярных индивидуальных дейтерированных БАВ в научных исследованиях
- Методы идентификации нуклеиновых кислот
- Методы амплификации нуклеиновых кислот.
- Использование D2O при исследованиях биосинтеза холестерина и жирных кислот
- Получение азотистых оснований (аденина и гуанина) нуклеиновых кислот кислотным гидролизом РНК
- Возможности применения интраоперационной флуоресцентной диагностики с использованием 5-аминолевулиновой кислоты в хирургии злокачественных глиом
- Возможности применения интраоперационной флуоресцентной диагностики с использованием 5-аминолевулиновой кислоты в хирургии злокачественных глиом
- п.6.5. Рациональное использование средств индивидуальной защиты в медицинских организациях.
- п.6.5. Рациональное использование средств индивидуальной защиты в медицинских организациях
- Научное обоснование целесообразности использования в медицинской практике настоя и настойки полыни эстрагон.
- Постмаркетинговые научные исследования
- учет и использование в деятельности юриста (...) индивидУАльных особенностей при воздействии на личность
- Этика научных исследований
- Научно-практическая значимость исследования