2 Методы физико- химического контроля белковых гидролизатов и приготовляемых на их основе питательных сред

2.1 Пробы дли исследования

Для исследования отбирают пробы гидролизатов, питательных сред объемом не менее 100 — 150см³. Пробы должны быть прозрачными без механических примесей, хлопьев, осадка.

2.2. Определение рН

Концентрацию водных ионов в пробах определяют потенциометрически, используя для этого различные типы отечественных и зарубежных рН - метров.

Определение величины рН проводят в соответствии с инструкцией прилагаемой к определённому типу рН - метра. Наиболее точные результаты могут быть получены при температуре 25 ± 1,5°С.

2.3 Определение содержания общего азота методом Къельдаля

Общий азот - это сумма азота белков, полипептидов, альбуминов, аминокислот, пептидов, солей аммония и др. Азот органических соединений при сжигании с концентрированной серной кислотой превращается в сернокислый аммоний, который при воздействии концентрированной щёлочи разлагается с выделением аммиака. Количество образующегося аммиака можно определять различными методами (Неслера, Коннея и др.). Общепринятым является метод Къельдаля. Для его осуществления необходимы следующие реактивы: концентрированная серная кислота, 33% -ный пергидроль, 30% - ный раствор NaOH, титрованный раствор 0,1Н серной кислоты, титрованный раствор 0,1 Н едкого натра, 0,1% - ный водный раствор метилоранжа, индикатор Таширо (смесь 0,2% -ного метилрота и 0,1 % - ной метиленовой смеси в соотношении 1:1).

Содержание общего азота определяют следующим образом. В къельдалевскую колбу из термостойкого стекла вносят 1см³ питательной среды или 5%-ного раствора гидролизата, добавляют 1см³ концентрированной серной кислоты и сжигают на песчаной бане с газовым или электрическим обогревом.

Выделяющейся аммиак отгоняют в круглодонную колбу (перегонная) емкостью 500 - 2000см³ соединенную через стеклянную трубку с колбой Къельдаля, которая соединена через каплеуловитель со стеклянным холодильником. Конец холодильника должен быть погружен в приемную колбу (колба Эрленмейера на 100 - 200см).

Минерализованный образец переносят из колбы для сжигания в колбу для отгонки путём обмывания первой небольшим количеством дистиллированной воды и добавляют несколько капель индикатора. Затем в колбу - парообразователь наливают воды на ³/₄ её объёма. В приёмную колбу отмеряют 10 - 20см³ 0,1Н раствора серной кислоты. В колбу с пробой вносят 30% - ный раствор гидрат окиси натрия до щелочной реакции по индикатору. Колбу - парообразователь нагревают на газовой горелке. Перегонку ведут до увеличения объёма жидкости в колбе - приёмнике в 2 -3 раза. К отгону добавляют 2-3 капли индикатора Таширо и титруют 0,1Н раствором гидрата окиси натрия до перехода окраски от фиолетовой до зелёной.

Расчёт количества общего азота ведут по формуле 1:

(AK₁-BK₂)1,4 x 100,

Х =------------------------------------,где ( 1 )

V

X - количество общего азота, мг%;

А - количество 0,1 Н серной кислоты, см³;

В - количество 0,1 Н раствора гидрата окиси, использованное для титрования, см³;

K₁ - поправка к титру 0,1 Н раствора серной кислоты;

К₂ - поправка к титру 0,1 Н раствора NaOH;

1,4 - количество азота в мг, эквивалентное 1см³ 0,1 Н раствора серной кислоты;

V - объём пробы в см³,взятой для исследования;

100 - пересчёт на 100см³ исследуемого материала.

2.4 Определение остаточного азота

Под остаточным азотам понимают азот веществ, оставшихся в растворе после осаждения белков.

В центрифужную пробирку вносят 5см³ исследуемой пробы и 5см³ 20% -ного раствора ТХУ, перемешивают, спустя 10 минут центрифугируют. Затем 2см³ центрифугата вносят в колбу Къельдаля, добавляют 1 см³ концентрированной серной кислоты и минерализуют, как указано в п. 2.3.

Расчёт остаточного азота проводят по той же формуле, что и для общего азота (V пробы = 1 см³).

2.5 Определение содержания белка

Классический метод определения белка сводится к определению с соответствующим перерасчётом белкового азота как разницы между общим и остаточным азотом.

Расчет белка проводят по формуле 2:

(А - В) х 6,25 ,

X =-------------------------- , где ( 2 )

1000

Х- количество белка, г %;

А - содержание общего азота, мг %;

В - количество остаточного азота, мг %;

6,25 - коэффициент перерасчёта азота в белок;

1000-пересчёт, г%;

2.6 Определение аминного азота

Под общим аминным азотом понимают азот свободных аминных групп низших полипептидов и аминокислот. В настоящее время существуют два основных метода определения аминного азота: газометрический метод Ван -Слайка и метод формольного титрования по Серенсену, а также множество их вариантов. Наиболее простым и общепринятым является метод формольного титрования Серенсена - Гаврилова. Способ основан на блокировании формальдегидом в нейтральной среде свободных аминогрупп с последующим титрованием карбоксильных групп щелочью. Считают, что определяемое при этом количество свободных карбоксильных групп эквивалентно количеству свободных аминогрупп.

Для постановки эксперимента необходимы следующие реактивы: 37%-ный формалин, нейтрализованный 0ДН раствором гидрата окиси натрия (50см3 формалина* 1см3 0,5%-ного спиртового раствора фенолфталеина), 0ДН титрованный раствор NaOH, 0ДН раствор серной кислоты.

Ход определения аминного азота состоит в следующим. В химический стакан вносят 1 — 2см3 2 % - ного раствора гидролизата или такое же количество питательной среды и добавляют 15 — 20см дистиллированной воды. Затем рН смеси доводят до 7,0 ОДрН раствором щёлочи или кислоты и вносят 2см3 нейтрализованного формалина. Далее, смесь титруют ОДрН раствором гидрата окиси натрия до рН 8,5.

Расчёт содержания аминного азота в исследуемом образце ведут по формуле (3 ) :

X ^ (A- BU К х 1.4 х 100 , где ( 3 ) V

X - количество аминного азота в мг %.

А - количество ОДрН раствора NaOH в см3, пошедшего на титрование

пробы;

В - количество 0,1Н раствора NaOH, пошедшего на титрование контроля;

К - поправка к титру ОД Н раствора едкого натрия;

1,4 - количество азота в мг, эквивалентное 1см3 ОД Н раствора едкого натрия;

V - объём пробы в см3 взятый на исследование;

100 - пересчёт на 100см3 пробы.

Параллельно проводят контрольное определение, расчёт которого ведут по формуле ( 4 ):

Х = А х 1.4 х К х 100 ,где ( 4 )

В

X - количественное содержание аминного азота в мг%;

А - разница между количеством O.lHNaOH в см³, пошедшего на титрование

испытуемого и контрольного растворов;

В - количество (см³ ) испытуемого раствора, взятого на титрование;

К - поправка до точно 0,1Н NaOH;

1,4 эквивалент азота, соответствующий 1см3 0,1 Н NaOH;

100 — пересчет на 100 см³ пробы.

2.7 Количественное определение свободного триптофана по М.А.Пешкову

Определение триптофана чаще всего используют в биологической промышленности как тест на полноту ферментативного гидролиза мяса при изготовлении переваров Хоттингера. Установлено, что содержание триптофана по мере расщепления белков мяса возрастает до 350-400 мг%, по окончании гидролиза - стабилизируется (250-300 мг%), а затем падает до 100-200 мг%.

Метод Пешкова основан на том, что при хлорировании триптофана образуется розовый монохлортриптофан. Реакцию считают законченной при исчезновении розовой и появлении желтой окраски.

Для определения свободного триптофана необходимы следующие реактивы: 1%-ный раствор хлорамина В, который содержит 26-29% свободного хлора, ледяная уксусная кислота.

Прежде, чем приступить к определению в пробе свободного триптофана, готовят 1%-ный раствор хлорамина В. Для этого 1 г сухого хлорамина растворяют в 99см³ воды и фильтруют. Затем, в пробирку вносят 1см питательной среды или 2%-ного раствора гидролизата, добавляют 4см³ дистиллированной воды, 1см³ ледяной уксусной кислоты и титруют 1%-ным раствором хлорамина. Последний прибавляют по каплям, осторожно встряхивая во избежание образования пены, которая может мешать наблюдению за интенсивностью изменения окраски. Реактив добавляют до тех пор, пока розовая окраска не начинает ослабевать и переходить в жёлтую или грязно-бурую.

Содержание триптофана в питательной среде выражают в мг%. Расчёт проводят по формуле 5:

Х = А х 100,где(5)

X — количество триптофана, мг%.

А - количество хлорамина (см³), пошедшее на титрование:

100 - пересчёт на 100 см³ раствора.

2.8 Определение содержания углеводов

Для определения содержания углеводов применяют колориметрический метод основанный на реакции их с антроном в кислой среде с образованием соединения, окрашенного в голубовато - зелёный цвет (иногда жёлто - зелёный) цвет, интенсивность окраски которого пропорционально содержанию углеводов в пробе.

Для определения количества углеводов в образце необходимы: 5% -ный раствор трихлоруксусной кислоты, концентрированная серная кислота, антроновый реактив, представляющий собой смесь 34 см³ дистиллированной воды и 66 см³ концентрированной серной кислоты. В горячий раствор этой смеси вносят 50 мг перекристаллизованного антрона и 1 часть тиомочевины.

Перекристаллизацию антрона ведут по следующей методике. Антрон вносят в колбу с обратным холодильником и растворяют в спирте, доведённом до кипения. На 100 г антрона берут 1000 см³ спирта.

Прежде, чем приступить к определению углеводов в исследуемой пробе, готовят разведения стандартного раствора глюкозы для построения калибровочной кривой. Схема приготовления разведений раствора представлена в таблице № 2.

Таблица 2

Приготовление разведений стандартного раствора глюкозы.

В каждую пробирку добавляют 1см³ концентрированной серной кислоты и 2 см³ антронового реактива, выдерживают 10 минут в кипящей водяной бане, охлаждают и колориметрируют при длине волны 620нм используя красный светофильтр в кюветах с рабочей длиной 5мм.

Основной опыт по определению углеводов ставят в следующей последовательности. В центрифужную пробирку вносят 4,5см³ 5%- ного раствора ТХУ и 0,5см³ исследуемой пробы, перемешивают и центрифугируют. Из центрифужной в обычную пробирку отбирают 0,5см³ надосадочной жидкости, добавляют 1см³ концентрированной серной кислоты и 2см³ антиронового реактива, перемешивают и выдерживают в кипящей водяной бане 10 минут. Содержимое пробирки охлаждают и колориметрируют при тех же условиях, что и при построении колибровочной кривой.

Содержание углеводов рассчитывают по формуле 6:

X = Ах 10 х 100 ,где ( 6 )

0,5

X - количество углеводов в мг%;

А - количество углеводов в мг, определенное по колибровочной кривой;

10 - коэффициент поправки на разведение образца;

0,5 - объём пробы в см³;

100 — пересчёт на 100 см³ образца.

2.9 Биуретовая реакция

В пробирку вносят 2см³ испытуемой питательной среды, добавляют 1,5 - 2см³ 30% - ного раствора NaOH, хорошо перемешивают и осторожно наслаивают 4-5 капель 0,5%- ного раствора сернокислой меди. Окраска раствора должна быть краснофиолетовой.

2.10. Определение содержание золы

В предварительно прокаленной тигель вносят 1-1,5 см³ исследуемой пробы питательной среды, выпаривают, а затем озоляют в муфельной печи при 500 - 600°С до постоянной массы.

Разница при последующих двух взвешиваниях должна быть не более 0,002г.

Содержание золы рассчитывают по формуле 6:

Х = (М₂-М) х 1ОО, где(6)

(М₁ - М)

М - масса пустого тигля в г;

M₁ - масса тигля со средой до озоления в г:

М₂ - масса тигля со средой после озоления в г.

2.11 Определение свободного индола

К 10см³ испытуемой среды добавляют 2-3 см³ амилового алкоголя, тщательно перемешивают, вносят 1см³ раствора азотистскислого калия в разведении 1:1000, 1см³ химически чистой серной кислоты и осторожно перемешивают. При этом не должно появиться розовое окрашивание, что является свидетельством отсутствия в среде индола.

2.12 Определение содержания тяжёлых металлов

Для определения содержания тяжёлых металлов 100см³ питательной среды высушивают, затем прокаливают в тигле в присутствии серной кислоты и 1 см³ насыщенного раствора ацетата аммония. После озоления среду разбавляют и фильтруют через бумажный фильтр. Тигель и фильтр

промывают 5 см³ воды. К 10 см³ фильтрата, доведенного разведённой уксусной кислотой или раствором натрия гидроокиси до нейтральной или слабокислой реакции, прибавляют 1см³ разведённой уксусной кислоты, 5 капель раствора сульфида натрия и перемешивают. В течении 5 минут не должно появиться осадка и жёлтого окрашивания.