3.Биологический контроль белковых гидролизатов и получаемых из них питательных сред

3.1. Сведения о тест-микроорганизмах, порядке хранения и работы с ними

Биологический контроль белковых гидролизатов и питательных сред приготовленных на их основе проводят с использованием тест-микроорганизмов по следующим показателям : чувствительности, скорости роста, эффективности, стабильности.

Для определения этих показателей в практической работе применяют рекомендованные ФГУ Всероссийским государственным Центром качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ) следующие тест - микроорганизмы :

l.Staphylococcus aureus «Лоссманов».

2.Escherichia coli 675.

3.Streptococcus faecalis 6783.

4.Streptococcus pyogenеs Dick 1.

5.Shigella flexneri ia 8516.

6.Corinebacterium diphiheroides № 1911.

Лиофилизированные культуры упомянутых бактерий хранятся при температуре 4 - 6 °С. Восстановление культур из лиофилизированного состояния проводят в жидких питательных средах, применяемых для культивирования конкретного вида микроорганизмов. При определении биологических показателей используют штаммы не подверженные диссоциации, для чего колонии тест - штамма просматривают визуально и под малым увеличением микроскопа. Кроме этого, 1 - 2 миллиардную взвесь микробных тел агаровой культуры в физиологическом растворе кипятят на водяной бане в течение часа. На плотной питательной среде должны быть колонии только в S- форме, а взвесь тест - микроба после кипячения должна оставаться гомогенной. Проверенные культуры тест - штамма засевают на полужидкий агар, выращивают, набирают в пастеровские пипетки с перетяжками, запаивают с двух концов и хранят при 4-6^оС 3-6 месяцев, используя по мере необходимости. Для биологического контроля испытуемых питательных сред применяют культуры тест-микроорганизмов, прошедшие не более 2 пассажей на рабочих средах.

3.2 Определение чувствительности и скорости роста

Под показателем чувствительности понимают десятикратное разведение культуры тест - микроорганизмов при засеве из которого на питательных средах обнаруживают видимый рост бактерий.

Для определения чувствительности тест - штаммы выращивают на плотной питательной среде, смывают физиологическим раствором, готовят взвесь с содержанием 1млрд. микробных тел в 1 см³. Затем путём последовательного переноса 0,5 см³ взвеси в 8 пробирок с 4,5см³ физраствора и тщательного перемешивания получают десятикратные разведения культуры. Из 4 - х последних пробирок (разведения 10^-5 – 10^-8) делают засев на плотную (в чашках Петри), в жидкую и полужидкую ( в пробирках) питательные среды, используя не менее 3-х чашек и пробирок на каждое разведение. Посевы выдерживают в термостате при температуре оптимальной для каждого определённого вида тест - штамма.

Чувствительность среды определяют по наибольшему разведению культуры при высеве из которого на всех засеваемых средах (чашках, пробирках) визуально обнаруживают рост микробов. Среду считают качественной в отношении чувствительности при обнаружении роста в чашках и пробирках засеянных культурой тест - штамма разведенной не менее, чем 10^-5. Скорость роста культур микробов определяют для каждого разведения взвеси через 12-24-48 часов выдерживания в термостате на плотных и 3-6-9 и т.д. до 48 часов на жидких и полужидких питательных средах.

Показателем скорости роста является минимальное время инкубации посевов (в часах) необходимое для появления видимого роста на всех засеянных средах. При появлении роста через 24-48 часов на всех засеянных средах их признают качественными в отношении упомянутого показателя.

3.3 Определение показателя эффективности

Под показателем эффективности понимают выход микробных тел с 1см³ питательной среды в единицах оптической плотности.

Эффективность жидких питательных сред определяют по концентрации микробных тел через определённый срок инкубации устанавливая изменения показателя оптической плотности (Е) на ФЭКЕ при длине волны 620 — 640 нм в кювете с рабочей длиной 5мм (ГОСТ 13805 — 76). Для оценки эффективности питательных сред ФГУ ВГНКИ рекомендует следующие значения для тест — культур :

Staphylococcus aureus «Лоссманов» - 0,4

Escherichia coli 675 – 05

Streptococcus faecalis 6783 - 0,3

Streptococcus pyogenes Dick 1-0,12

Shigella flexneri ia 8516 - 0,15

Corinebacteririum diphteroides № 1911 - 0,12

3.4 Определение стабильности основных свойств культур тест-штаммов

Стабильность основных свойств культур - это отсутствие в испытуемых питательных средах микроорганизмов атипичных по культурально-морфологическим и биохимическим свойством и, напротив, наличие бактерий со свойствами, характерными для использованного тест-штамма.

Для определения стабильности в испытуемые жидкие, полужидкие и на плотные питательные среды делают посев бактерий определённого тест-штамма и после соответствующей инкубации изучают морфологические, культуральные и биохимические свойства выросших культур, используя при этом общеизвестные в микробиологической практике методики.

Испытуемую среду признают качественной при наличии в ней типичных для взятого в опыт вида бактерий и отсутствии их диссоциации.