Методические рекомендации по культивированию возбудителей инфекционных заболеваний и приготовлению питательных сред, используемых в ветеринарных диагностических лабораториях

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/135)

Методические рекомендации подготовили: А.Э. Высоцкий, А.П. Лысенко, З.Н. Барановская, И.И. Румачик, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, Г.Е.

Общие положения

Настоящие Методические рекомендации определяют порядок приготовления питательных сред, предназначенных для диагностических ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских организаций и высших учебных заведений ветеринарного профиля и используемых при диагностике болезней животных (включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел).

При приготовлении и контроле общеупотребительных питательных сред из числа биофизических факторов основное внимание уделяется контролю рН сред и окислительно-восстановительному потенциалу.

Контроль и стабилизация рН питательных сред

Каждый вид бактерий требует оптимального изначального значения рН питательной среды, кроме того, в процессе роста, в зависимости от природы утилизируемого субстрата, может происходить защелочение, например, за счет дезаминирования аминокислот, пептона или закисление при расщеплении углеводов. Поэтому в ряде случаев в питательные среды для стабилизации рН добавляют буферные смеси.

Ориентировочную оценку рН можно провести при помощи индикаторных бумажек — полосок фильтровальной бумаги, пропитанных соответствующим индикатором, к которым прилагается цветовой указатель со шкалой рН. Универсальный индикатор можно приготовить по следующему рецепту: тимолблау — 5 мг, метилрот — 12 мг, бромтимолблау — 100 мг, добавить 0,1н NаОН до зеленого цвета и воды дистиллированной до 200 мл. Далее определяют рН — к капле раствора добавляют каплю индикатора и на белом фоне смотрят цвет смеси. Цвет универсального индикатора при различных значениях рН следующий: 4,0 — красный, 5,0 — оранжевый, 6,0 – желтый, 7,0 — зеленый, 8,0 — синий, 9,0 — цвет индиго, 10,0 — фиолетовый.

Более точным является буферный метод определения рН, его точность зависит от качества приготовленного буфера. Характеристики и рецепты индикаторов для данной цепи приведены в таблицах 1 и 2. Можно использовать для контроля различные буферные смеси, в том числе ацетатно-фосфатно-боратную универсальную буферную смесь (рН 3,29-11,98). Основной раствор состоит из 5,4468 г однометаллического фосфата калия (КН₂РО₄), 2,481 г борной кислоты и 2,5 мл уксусной кислоты, 1000 мл нейтральной дважды перегнанной дистиллированной воды.

На каждые 100 мл такого раствора прибавляют 0,2 нормального раствора NаОН в следующих количествах:

Объем каждой смеси доводят дистиллированной водой до 200 мл.

Техника определения рН сводится к следующему. Испытуемый раствор отдельными порциями смешивают с несколькими индикаторами и находят тот индикатор, который дает переходные тона окраски. Затем берут для сравнения несколько буферных смесей с близкими значениями рН и делают вывод о величине рН испытуемого раствора. В некоторые питательные среды индикаторы вводят как составной компонент, что позволяет судить о сдвиге рН в процессе культивирования микроорганизма, например в дифференциально-диагностические жидкие, полужидкие и плотные среды.

Для точного определения рН используют рН-метр. Прибор включают в сеть и прогревают не менее 30 минут. Электроды перед погружением в контролируемый или буферный раствор тщательно промывают дистиллированной водой, остатки воды с электродов убирают фильтровальной бумагой. Электроды перед погружением в стакан с контролируемой жидкостью должны не доходить на 4-6 мм до дна сосуда. В случае измерения рН растворов, температура которых меняется, целесообразно применять автоматическую и температурную компенсацию, с постоянной температурой — ручную термокомпенсацию. Отсчет по шкале показывающего прибора проводят после установления показателей, что обычно составляет около трех минут, при 0^оС – 10 минут. По завершении работы электроды для измерения рН должны оставаться погруженными в воду. Прибор настраивают и контролируют по стандартным буферным растворам со значениями рН в диапазоне, на котором проводятся измерения. Настройку проводят при температуре, которая будет использована при последующей работе.

Буферные растворы готовят из растворов фиксаналов квалификации «для рН-метрии», рассчитанных на 1000 мл буферного раствора. При этом применяют предварительно прокипяченную в течении 30 минут для удаления СО₂ дистиллированную воду.

Достаточно сложные питательные среды обычно сами обладают определенной буферностью за счет присутствия кислых и основных групп белка, пептидов, аминокислот. Для увеличения буферной емкости среды в них иногда добавляют буферные растворы. Наиболее часто для этого используют ацетатный, фосфатный и трис-буферы. Прописи буферов для бактериологических сред представлены в таблице 8.

При добавлении к средам фосфатных буферных растворов и последующем нагревании неорганические фосфаты выпадают в осадок в виде фосфатов кальция. Этого явления можно избежать, добавляя буфер к стерильному бульону (рН 7,7), нагретому до 37° С, или расплавленному агару с температурой 50^о С с последующим охлаждением до комнатной температуры. Перечисленные буферные растворы не могут стабилизировать рН при росте сильных кислотообразователей (молочнокислые бактерии), в этом случае в среду вносят до 0,3% измельченного СаСО₃. В случае культивирования бактерий в ферментерах задача поддержания рН на оптимальном уровне решается путем постоянного автоматического контроля рН и подачи раствора щелочи или 10%-ного стерильного раствора NaНСO₃ при закислении среды.

Полуфабрикаты питательных сред

Мясная вода. Основой мясо-пептонного питательного бульона и агара является мясная вода, которую готовят следующим образом. Мясо (говядина) освобождают от жира, фасций, костей, пропускают через мясорубку, к 1 кг фарша добавляют 2 литра дистиллированной воды, кипятят 1 час, отстаивают, фильтруют через полотно или бумагу, доливают водой до исходного объема, разливают по емкостям и стерилизуют 30-40 минут при 120^оС.

Сброженную мясную воду готовят путем добавления к 1 кг мясного фарша 2 литров воды, затем смесь подогревают до 40^оС, вносят 4 г хлебных дрожжей и выдерживают 18-20 часов при 37 ^оС. Далее фарш отжимают, мясную воду кипятят 30 минут, фильтруют, стерилизуют. Сброженную мясную воду используют как основу сред для определения сахаролитических свойств анаэробов, углеводный компонент в среде расщепляется дрожжами.

Гидролизные полуфабрикаты

В настоящее время питательные среды на основе гидролизатов, как достаточно эффективные и экономичные, широко используют в микробиологической практике. Из этой группы наиболее известен перевар Хоттингера. В качестве субстратов для гидролизата применяют кроме мяса и кровяных сгустков казеин, причем гидролизат в зависимости от степени расщепления дифференцируют по номерам (№ 1-5), желатин, рыбу, китовую муку, криль и т.д. Сам процесс гидролиза осуществляется ферментативным путем (пепсин; трипсин и пептидазы, чаще в виде панкреатина, свежей или консервированной поджелудочной железы; протеазы рыб, дрожжей, плесневых грибов) или химическим (кислотным) способом. Коммерческие общеупотребительные сухие питательные среды сконструированы на основе тех или иных гидролизатов.

Перевар из кровяных сгустков. Сгустки промывают, взвешивают, берут тройное количество воды, вносят в нее сгустки крови и кипятят 30 минут, помешивая. Затем сгустки вынимают, измельчают, объем жидкости дополняют дистиллированной водой до исходного, далее на 1 кг сгустков добавляют 3 литра отвара, доводят рН до 8,0-8,2, охлаждают смесь до 38-40 ^оС, вносят фарш поджелудочной железы или панкреатин и потом все операции проводят по схеме изготовления перевара Хоттингера из мяса. Перевар из кровяных сгустков отличается высокой питательностью и буферностью.

Кислотный гидролизат казеина. Смешивают 1,2 литра НС1 (удельный вес 1,19), 600 мл дистиллированной воды, 1200 г сухого казеина, помещают в бутыль, закрывают ватно-марлевой пробкой с бумажным колпачком, прогревают в автоклаве 3 часа при 1,5 атм.

Основной пептон Мартена. Свиные желудки освобождают от жира, пленок, не промывая режут на куски и пропускают через мясорубку. К 1 кг фарша добавляют 5 л воды с температурой 50°С, 50 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь перемешивают, наливают в бутыль и выдерживают при 45-48^оС в течение 24 часов, периодически встряхивают. Надосадочный слой осторожно сливают, подогревают при 80°С в течение 10 минут, затем стерилизуют текучим паром 30 минут. Использовать пептон можно через 5 суток. Хранят в прохладном месте.

Триптический перевар Хоттингера. Говядину освобождают от жира, сухожилий, костей, мелко рубят, смешивают с водой из расчета 1 кг мяса на 1 литр воды. Смесь кипятят 15-20 минут, затем мясо пропускают через мясорубку, фарш смешивают с бульоном и смесью заполняют на 2/3 бутыли. Устанавливают рН смеси 20%-ным раствором бикарбоната натрия на уровне 7,8-8,0, вносят фарш поджелудочной железы из расчета 100 г на 1 литр смеси или панкреатин в количестве 0,5% или более Поджелудочную железу предварительно очищают от жира, соединительной ткани и дважды пропускают через мясорубку. Через 1-2 часа после внесения фарша поджелудочной железы (поджелудочную железу можно использовать свежую, замороженную или соленую; свежую железу можно консервировать впрок, для этого ее превращают в фарш и заливают в стерильной банке глицерином (можно хранить в холоде 2-3 месяца); консервирование поваренной солью проводят следующим образом: к железе добавляют 15% соли (вес /вес), допускается хранение до 6 месяцев) или панкреатина проверяют рН и корректируют его на уровне 7,4-7,6. Содержимое бутыли перемешивают, вносят на 1 литр смеси 10-30 мл хлороформа, бутыль перемешивают каждые 15-20 мин, затем через 2-3 часа, далее по нескольку раз в день, удаляя на этот период пробку. Бутыль выдерживают в термостате при температуре 46-48^оС в течение 4-5 суток. О завершении переваривания свидетельствует: образование на дне бутылки пылевидного осадка; жидкость над осадком имеет соломенно-желтый цвет; перевар легко фильтруется; реакция на триптофан положительная. С этой целью из бутылки берут 3-4 мл перевара, фильтруют, добавляют 3-4 капли бромной воды (к 100 мл дистиллированной воды добавляют 3-3,5 мл чистого брома, хранят в темной склянке в темноте). На наличие триптофана указывает розово-фиолетовая окраска жидкости. Гидролизат фильтруют и в фильтрате определяют азот по Кьельдалю. Основной гидролизат обычно содержит 500-800 мг% азота.

Таблица 1

Индикаторы, пригодные для определения рН буферным методом, изменение их окраски в определенных пределах рН и рецепты

Таблица 2

Прописи наиболее часто используемых в бактериологических средах буферов

^а х мл 0,2 М уксусной кислоты + (50-х) мл 0,2 М ацетата натрия, довести водой до 100 мл.

^б х мл 0,1 М лимонной кислоты + (50-х) мл 0,2 М Nа₂НР0₄, довести водой до 100 мл.

^в х мл 0,2 М Nа₂НР0₄ + (50-х) мл 0,2 М Nа₂НРО₄ довести водой до 100 мл.

^г 50 мл 0,2 М триса + х мл 0,2 М НС1, довести водой до 100 мл.

По окончании гидролиза перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бутылки и стерилизуют 30 минут при давлении 1 атм (120°С) для хранения впрок. Перед употреблением фильтруют.

Растительные гидролизаты

На территории Республики Беларусь применяют горохово-гидролизатные среды по Бучневу, гидролизаты дрожжей

Основной гидролизат по Бучневу готовят следующим образом. Используют гороховую муку крупного помола, которую замачивают водой с температурой 10-12°С и рН 7,8-8,0 (устанавливают при помощи 1N раствора NаОН) из расчета 60 г муки на 1000 мл воды и 2,5 г натрии хлорида. Экстрагирование проводят в кислото-щелочеустойчивых бутылях в течение 24 часов. В первые 8-9 часов оседающую муку перемешивают, далее через 15-16 часов после оседания взвеси сифоном осторожно сливают надосадочную жидкость (гороховый настой) и подвергают ее обработке пепсином, а затем панкреатином.

Гидролиз горохового настоя пепсином. Настой нагревают до 50°С, устанавливают при помощи 1N НС1 рН 2,0 и вносят пепсин до конечной концентрации 0,15%; выдерживают смесь 22-24 часа при 37-38°С и в течение этого времени дважды перемешивают.

Гидролиз панкреатином. Обработанный пепсином гороховый настой подщелачивают 1N NаОН до рН 8,2, добавляют панкреатин до 0,1%, выдерживают 3,5 часа при температуре 47-50°С, периодически перемешивая.

Осветление гидролизата. Сразу после обработки панкреатином гидролизат подкисляют до рН 5,0-5,2 при помощи 1N НС1, кипятят 15 минут, отстаивают 20-25 минут, надосадочную жидкость сливают сифоном и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат подщелачивают 1N NаОН до рН 7,8, кипятят 15 минут, вновь фильтруют и стерилизуют 30 минут при давлении 0,8-1 атм. Гороховый гидролизат используют в качестве основы для приготовления горохово-гидролизатного бульона (0,25% пептона) или аналогичного по составу горохово-гидролизатного плотного или полужидкого агаров, которые можно обогащать глюкозой (0,5%), азотнокислым аммонием (0,5%).

Аутолизат дрожжей. В 1000 мл дистиллированной воды суспендируют 200 г пивных дрожжей, после оседания дрожжей добавляют 2 г одноосновного фосфорнокислого натрия. При помощи 1N NаОН устанавливают рН 6,1, вносят 5 мл хлороформа, смесь выдерживают при 37° С в течение 48 часов, доводят рН до 7,4, кипятят 30 минут, фильтруют через бумагу, стерилизуют. Используют вместо мясной воды.

Характеристики некоторых гидролизатов представлены в таблице 3.

Печеночная вода. Печень освобождают от фасций, жира, готовят фарш, смешивают его в соотношении 1:2 с водой и кипятят 30 минут при помешивании, отстаивают, жидкость сливают, дополняют водой до первоначального объема и фильтруют через бумагу. Фильтрат разливают по емкостям, стерилизуют 30-40 минут при 120° С.

Таблица 3

Содержание общего и аминного азота в гидролизатах

Основные жидкие питательные среды

Мясо-пептонный бульон. К мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида и кипятят, помешивая, и течении 30-40 минут, предварительно замерив её уровень, и потом доливают дистиллированную воду до исходного уровня. Можно предварительно разбавить мясную воду 1:1 дистиллированной водой. Затем при помощи 20%-ного раствора едкого натра устанавливают необходимый уровень рН с учетом, что в ходе стерилизации рН понизится. Например, если необходимо приготовить бульон с конечным рН 7,6, то желательно на этом этапе установить рН 8,0.

При изготовлении агаровой среды, сахарного бульона изначально рН среды надо доводить до 8,2-8,3. В случае необходимости для стабилизации рН среды на этой стадии можно вносить буферные смеси. После кипячения вновь контролируют рН среды. После установления рН бульон кипятят повторно 30 минут, отстаивают, фильтруют через бумажные фильтры, фасуют и стерилизуют при 1 атм в течение 30 минут. Можно для получения более прозрачной среды автоклавировать ее в бутылях. После отстаивания фильтрат МПБ разливают по рабочим емкостям (пробирки, колбы) и автокла-вируют дополнительно.

Мясо-пептонный печеночный бульон. Печень крупного рогатого скота режут на куски по 150-300 г, заливают 1:1 водой и варят 60 минут, считая с момента закипания. Экстракт фильтруют через ватный фильтр, объединяют с МПБ в соотношении 1:3, доводят до кипения, вносят натрия хлорид из расчета 1,25 г/л, устанавливают рН 7,8-8,2, кипятят 15 минут, фильтруют через бумажный фильтр, стерилизуют 40 минут при 120° С.

Бульон на переваре Хоттингера. Основной перевар Хоттингера разводят дистиллированной водой до 80-150 мг% азота, в зависимости от вида бактерий, которые предполагается культивировать (возбудитель рожи свиней – 80-120 мг%; бруцеллы — 100 мг%; возбудитель эмфизематозного карбункула – 100-120 мг%). Затем добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 0,1% двузамещенного фосфата натрия, устанавливают рН 7,4-7,6, кипятят 15-20 минут, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120^оС в течение 20-30 минут.

Бульон Мартена. Из бутыли пептон Мартена отсасывают сифоном, нагревают до 80° С, добавляют 0,1% ледяной уксусной кислоты, кипятя 5 минут при помешивании, подщелачивают 20%-ным раствором NaОН до рН 8,0-8,2. Кипятят 10 минут, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, смешивают 1:1 с мясной водой, добавляют 0,5% NаС1, снова контролируют рН, кипятят 15 минут, фильтруют через бумагу, разливают по емкостям. Стерилизуют при 0,5 атм 30 минут или текучим паром три дня по 30 минут.

Приготовление плотных и полужидких питательных сред

Плотные и полужидкие питательные среды готовят на основе жидких питательных сред путем добавления к ним уплотнителей.

Уплотнители питательных сред

Агар-агар — полисахарид, является наиболее распространенным уплотнителем. Экстрагируют из некоторых морских водорослей, состоит из агарозы, агаропектина и примесей. Для целей культивирования бактерий пригоден агар квалификации «бактериологический», безусловно могут быть использованы «очищенный» и «специальный агар», особенно при изучении метаболических потребностей, но чаще их применяют для постановки РДП и проведения иммуноэлектрофореза. Агар как уплотнитель выгоден благодаря прозрачности, устойчивости к бактериальным ферментам, а также сохранению состояния геля до температуры почти 90° С.

Обычно агар добавляют к средам в количестве 2-3% (плотные среды) или 0,15-0,4% (полужидкие среды). Для выращивания некоторых бактерий более подходят среды с 1,5% агара (влажные или мягкие среды). Уплотняющие характеристики агара могут несколько варьировать в зависимости от сорта (марки). Агар сохраняет свои свойства в полной мере при рН, близкой к нейтральной; при кислых значениях среды в процессе нагревания он будет гидролизоваться, поэтому когда готовят среды с рН 6,0 и ниже, вначале их стерилизуют с агаром при нейтральных значениях рН, а только потом стерильной кислотой доводят рН до требуемого уровня.

Растворять агар перед автоклавированием в среде желательно в водяной бане, так как нередко при нагревании на открытом пламени агар пригорает и карамелизуется.

Готовые агаровые среды разливают а пробирки и чашки Петри. Нежелательно чрезмерное увлажнение и высыхание агаровых сред в чашках, поэтому агар разливают в чашки охлажденным до 45-50^оС и прикрывают первоначально стерильной бумагой и только после уплотнения стекляными крышками. Капли воды, образующиеся на поверхности агара устраняют выдерживанием чашек в течение суток при 22-37°С в перевернутом состоянии. Чрезмерного высыхания агаровых сред избегают хранением в полиэтиленовых пакетах. Среды должны храниться в темноте во избежание образования ингибиторов роста, типа перекиси водорода.

Желатина — белок из хрящей, кожи, костей животных. Малопригоден в качестве уплотнителя сред, так как плавится при температуре 23-26°С т.е. переходит в жидкое состояние при температурах, которые необходимы для культивирования большинства патогенных бактерий, кроме того, расщепляется протеолитическими ферментами многих бактерий.

Силикагель (кремнекислый гель) используют в основном при конструировании синтетических сред, культивировании автотрофных бактерий, определении потребности бактерий в источниках углерода, витаминах. Рекомендуется следующая процедура приготовления сред с таким уплотнителем. Готовят раствор, силиката калия: к 100 мл 7%-ного КОН добавляют 10 г силикагеля или кремниевой кислоты, нагревают до растворения компонентов, стерилизуют в автоклаве, смешивают 20 мл стерильной питательной среды двойной концентрации с 20 мл раствора силиката и вносят 20%-ный раствор о-фосфорной кислоты в количестве, необходимом для установления рН 7,0 (доза фосфорной кислоты определяется в предварительных опытах). Смесь сразу разливают в чашки Петри.

Мясо-пептонный агар. К МПБ добавляют 2-3% агар-агара, устанавливают рН 7,1-7,2, фильтруют через вату, разливают по емкостям, стерилизуют при 120° С в течение 15-30 минут. По аналогичной схеме готовят агаровые среды на основе гидролизатных жидких сред: агар Хоттингера, агар Мартена и т.д.

Полужидкий агар. К мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% двухосновного фосфорнокислого натрия, 0,5% натрия хлорида, 0,2-0,3% агар-агара, нагревают до растворения компонентов (агар можно предварительно расплавить отдельно). Устанавливают рН 7,8 постепенным внесением раствора едкого натра и спустя 40-50 минут фильтруют через вату, разливают по емкостям и стерилизуют при 115°С в течение 40 минут.

Мясо-пептонная желатина. К 1000 мл МПБ добавляют 10-15% желатины, устанавливают рН 7,0 добавлением раствора бикарбоната натрия. Более щелочную реакцию среды делать нельзя, так как желатина в этом случае плохо застывает. Затем среду в горячем виде фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 7-8 мл в пробирки. Стерилизуют дробно, три дня подряд текучим паром или при 110^оС в течение 20 минут. Охлаждают среду в вертикальном положении.

Фильтрование и осветление питательных сред

Жидкие питательные среды пропускают через двойной ребристый фильтр из фильтровальной бумаги (предварительно смачивают водой), фильтровальное полотно. Агаровые среды в расплавленном состоянии фильтрую через ватно-марлевый фильтр из гигроскопичной ваты. Желатиновые среды фильтруют через бумажный, смоченный горячей дистиллированной водой фильтр.

Осветление агара проводят добавлением сыворотки крови или яичного белка. На 1-2 литра агара с температурой 50°С вносят белок одного куриного яйца, предварительно размешанный 1:2 в холодной воде или 25-50 мл сыворотки крови, затем среду тщательно перемешивают и кипятят 10-15 минут. Сформировавшийся осадок отделяют фильтрованием, прозрачную среду разливают по пробиркам и колбам.

Прозрачный агар можно получить, оставляя сваренную на текучем пару (1 час) среду в теплом месте до застывания. Нижнюю часть среды с осадком удаляют, прозрачный слой измельчают, расплавляют текучим паром (1-1,5 часа), корректируют рН, фильтруют. Нежелательно подщелачивать готовый агар, так как после стерилизации может вновь выпасть осадок. Необходимо учитывать, что многократное кипячение и автоклавирование снижает уплотняющие свойства агара.

Сухие питательные среды

В бактериологии в основном используют сухие питательные среды, что освобождает лаборатории от трудоемкого процесса их изготовления. Из числа общеупотребительных сухих сред наиболее часто применяют сухой агар из панкреатического гидролизата панциря криля, питательный агар из ферментативного гидролизата кормовых дрожжей, питательный бульон из триптического гидролизата кильки и др.

Сухие питательные среды необходимо хранить в герметически закрытых емкостях в темноте при 5-25°С, т.к. из-за гигроскопичности порошкообразное содержимое может образовывать комки, а на свету менять свои характеристики, особенно если это сухие дифференциально-диагностические среды.

Приготовление бульона. Состав среды (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05, натрия хлорид — 4,95. Навеску порошка массой 15 г растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, затем нагревают в водяной бане до кипения и кипятят в течение двух минут, фильтруют через бумажный фильтр, проверяют и корректируют в случае необходимости рН (7,3), разливают по емкостям, пробиркам и стерилизуют 20 мин при 120^оС.

Приготовление агара. Состав среды (г/л), например, на основе гидролизата дрожжей: гидролизат дрожжей – 12,0, натрия хлорид — 5,5, агар – 12,5; гидролизата панциря криля — 23,1, натрия хлорид — 7,7, агара — 11,2. В обоих случаях 35-36 г порошка растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, кипятят три минуты, фильтруют через вату, контролируют рН (7,3-7,6), разливают по емкостям и стерилизуют.

Добавки природного происхождения, факторы роста, антитоксические вещества

Для обеспечения роста бактерии с различными метаболическими особенностями в общеупотребительные к особенно в синтетические питательные среды вносят добавки: факторы роста, детоксицирующие вещества и т.д. Характеристики основных добавок подобного рода приведены ниже.

Витаминные добавки

Дрожжевой экстракт. Используют как источник витаминов и других факторов роста, в том числе пуринов и пиримидинов для сред на основе гидролизатов мяса и казеина. Существует ряд методов получения экстракта. Наиболее доступен следующий: 250 г прессованных хлебных дрожжей суспензируют в 1000 мл дистиллированной воды, кипятят до отхождения пены (около 5 минут), фильтруют через бумажный фильтр, к фильтрату добавляют хлороформ и хранят в закрытых емкостях в темноте. Перед стерилизацией экстракт разводят питательной средой 1:10.

Тиамин (В₁). Большинство бактерий является ауксотрофами по тиамину, который, например, оказывает заметное стимулирующее действие на рост стафилококков. Его добавляют в питательную среду в количестве 1-10 мг на 1000 мл. Солянокислый тиамин растворяют в воде. При автоклавировании в водных растворах с рН 5,0 и более расщепляется, стерилизуют фильтрованием.

Витамин К. Необходим для роста неспорообразующих анаэробов: Fusobacterium, Bacterioides, а также Мусоbacterium. Обычно рекомендуется добавлять в среду в форме менадиона (2-метил-1,4 нафтохинон; спиртовой раствор), который устойчив к автоклавированию, в количестве около 5 мг на 1000 мл среды.

Кобаламин (В₁₂). Косвенно участвует во многих метаболических реакциях бактерий, стимулирует рост некоторых штаммов Е. соli, Lactobacillus. Стерилизуют автоклавированием, добавляют 1 мг на 1000 мл питательной среды.

Биотин (В₇). Участвует в различных биосинтетических реакциях, стимулирует рост Сlostridium, Staphylococcus, Streptococcus. Слаборастворим в воде, но соли растворяются легко, можно автоклавировать. В среде должен быть в концентрации 10^-12.

N-Аминобензойная кислота. Является предшественником в синтезе фолиевой кислоты. Наличие в среде в достаточном количестве тиамина, метионина, пуриновых оснований, витамина В₁₂ может резко снизить потребность бактерий в ней. Оптимальное количество в питательной среде 250 мкг/1000 мл.

Фолиевая кислота и ее производные. Участвует в качестве кофактора в синтезе пантотеновой кислоты, метионина, серина, пуринов, тиамина. В воде растворяется плохо, аммониевая соль растворяется хорошо и устойчива к автоклавированию. Оптимальное содержание в питательной среде около 200 мкг/1000 мл.

Никотиновая кислота и ее производные. Необходимы для ауксотрофов по этой группе соединений. Коферментные формы витамина — NAD и НАDP (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) — участвуют в окислительно-восстановительных реакциях. NAD необходим для роста Heamophilis, некоторых видов Actinobacillus и Pasterellа, стерилизуют фильтрованием. Оптимальная концентрация в питательной среде 1-5 мг/1000 мл.

Витамин В₆. В эту группу входят пиридоксин, пиридоксаль и их производные, наиболее часто используют пиридоксаль. Стимулирует рост стрептококков. Устойчив к нагреванию, но рекомендуется стерилизовать отдельно от других компонентов среды, так как пиридоксаль реагирует с ними, чувствителен к свету. Оптимальная концентрация в питательной среде ~ 5 мг/1000 мл.

Железопорфирины. Являются компонентами электронно-транспортных систем. Гемофильные бактерии не способны синтезировать эти соединения. Для обеспечения их потребности, стимуляции роста неспорообразующих анаэробов используют гемин (Х-фактор роста) в концентрации 5-20 мг/1000 мл среды.

Кровь, обработанная пепсином. Используют для стимуляции роста бактерий рода Наеmophilus, добавляют к средам в количестве 2-5%. Приготовление: 150 мл 0,9% водного раствора натрия хлорида автоклавируют при 120°С в течение 15 минут в колбе под притертую пробку, но закрытую ватно-марлевой повязкой. После стерилизации в колбу добавляют концентрированную НС1 — 6 мл; стерильную дефибринированную кровь барана — 50 мл; пепсин — 1 г и выдерживают 24 часа в водяной бане при 55°С, перемешивая в течение двух первых часов. Затем вносят 12 мл 20%-ного NaОН и далее дробно до рН 7,6, затем внесением 1N НС1 рН понижают до 7,0-7,2, вносят 0,5 мл хлороформа. Закрывают колбу притертой пробкой и хранят в холодильнике.

Аминокислоты. Алании, аспарагин, солянокислый аргинин, солянокислый гистидин, изолейцин, лейцин, солянокислый метионин, треонин, валин, фенилаланин, серин, пролин, оксипролин и глицин растворяют в воде. Другие аминокислоты растворяют в кислоте или щелочи: в 0,2-0,4н растворе NaОН, цистин и триптофан в 0,2-0,4N растворе соляной кислоты. Все аминокислоты, кроме глутамина, устойчивы к автоклавированию. Патребность бактерий в аминокислотах часто связана с отсутствием в среде соответствующего витамина, способствующего их синтезу. DL-аминокислоты действуют обычно как и L-соединения, однако D-изомеры могут проявлять ингибирующее действие. Основные растворы аминокислот должны содержать 100-1000 мг вещества на 1000 мл. В состав анаэробных сред как редуцирующее вещество часто включают L-цистеин/цистин из расчета 300-500 мг/1000 мл. Для обеспечения роста стрептококков, пневмококков вносят в среды глутамин из расчета 5-100 мг/1000 мл.

Пурины, пиримидины, нуклеотиды и нуклеозиды. Базовые растворы готовят в концентрации 100-1000 мг/100 мл, урацил – для лучшего роста C. tetani, гемолитических стрептококков, нейссерий из расчета 2-5 мг/1000 мл среды; гипоксантин для обеспечения роста нейссерий, возбудителя столбняка — 100 мг/1000 мл среды.

Аденин, гуанин, тимин и цитозин растворяют в 0,1 N растворе НС1, ксан-тин и урацил — 0,1N растворе NaОН.

Жирные кислоты и родственные соединения. Любая из активных жирных кислот может включаться в липидные вещества прокариот. Сложностью их применения является то, что необходимые концентрации особенно ненасыщенных жирных кислот одновременно могут быть и токсическими. Поэтому их используют одновременно с детоксицирующими веществами (белки, альбумины, твины, лецитин). Потребность в стероидах особенно выражена у микоплазм, например в холестерине. Сыворотка крови содержит такие жирные кислоты, как олеиновую, стеариновую и др. Источником водорастворимых липидов вместо сыворотки может служить желчь, которую добавляют в среды для сальмонелл, других энтеробактерий, некоторых псевдомонасов (Р. аеruginosa), моракселл в концентрации 0,5-2 г/1000 мл. Желчь крупного рогатого скота при отсутствии коммерческих препаратов получают следующим образом: вырезают при убое животных желчный пузырь, желчь переливают в стерильную емкость, выдерживают 60 минут в аппарате Коха, отстаивают, фильтруют и стерилизуют дробно три дня подряд по 20 минут текучим паром. Натриевые соли жирных кислот обычно растворяют в воде, в других случаях их растворяют в 96%-ном этаноле или твине.

Вещества, обладающие антитоксическим и защитным действием

Активированный уголь. Обладает способностью адсорбировать и нейтрализовать токсические вещества. Особенно часто его включают в состав сред например в казеиново-угольный агар (КУА) для бордетелл добавляют 0,3% сухого активированного угля.

Асцитическая жидкость. Используют как детоксицирующий компонент питательных сред для выращивания стрептококков, пневмококков, нейссерий. Добавляют 10-25 мл на 100 мл питательной среды.

Кровь. Обладает антитоксическим действием — адсорбирует токсины. Обычно используют кровяной агар и бульон. В первом случае к стерильному и охлажденному до 50°С агару добавляют 5-10-20% стерильной де-фибринированной крови (барана, кролика и т.д.), перемешивают и разливают по чашкам Петри, пробиркам. В питательней бульон вносят 1-5% стерильной дефибринированной крови. Нередко особенно при культивировании анаэробов, в кровяные среды добавляют как универсальный источник энергии глюкозу (до 1%). Раствор глюкозы стерилизуют фильтрованием, дробно текучим паром или при 0,5 атм в течение 30 минут. Кровяные среды, помимо стимуляции роста, дают возможность определения гемолитической активности бактерий.

Сыворотка крови. Не является собственно питательным субстратом, обладает антитоксическим действием, придает среде свойство буферности, с одной стороны, сорбирует жирные кислоты, с другой — является источником активных жирных кислот. Используют при конструировании питательных сред стерильную, без консервантов сыворотку крови крупного рогатого скота, включая телячью, лошадиную, кролика. В питательные среды сыворотку крови вносят в количестве от 0,5 до 53% (объем/объем). Сыворотку рекомендуется инактивировать при 56°С в течение 30 минут. При изготовлении сывороточного агара (рН 7,4-7,6) к остуженной до 45- 50°С среде добавляют 5-25% сыворотки, сывороточный агар для анаэробов обычно дополняют 2% глюкозы. По аналогичной схеме готовят сывороточный бульон.

Твин 40, 60, 80. Используют в составе питательных сред для обеспечения коллоидных свойств при культивировании микроорганизмов рода Вгucella, Gardenerela, Рasteurellа. Оптимальная концентрация в составе среды 50-100 мг/1000 мл.

ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП

Обеспечение оптимального температурного режима

При довольно широком температурном диапазоне оптимальная зона роста бактерий обычно узкая и часто находится очень близко к максимальной границе. Если при культивировании температура ниже оптимальной, это приводит к замедлению роста. Превышение максимума нередко дает быструю гибель клеток. В ряде случаев в качестве дифференциального признака при идентификации бактерий используют их способность к росту при определенных температурах. Точное соблюдение температурного режима в этих случаях приобретает принципиальное значение.

Наибольшие колебания температуры имеются в воздушных термостатах конвекционного типа, гак как при открывании термостата часть теплого воздуха замещается холодным и перепады иногда достигают нескольких градусов. Более стабильная температура поддерживается в термостатах с водяной рубашкой. В определенных ситуациях для особо точного определения воздействия температуры на рост микроорганизмов целесообразно использовать водяные бани с перемешиванием в них воды. В ходе культивирования бактерий в термостатах рекомендуется измерять температуру в различных участках, размещая там термометры в пробирках с водой. В воздушных термостатах культуральные сосуды размещают таким образом, чтобы они не попали в «мертвое» воздушное пространство, слабо затрагиваемое конвекционными потоками. Любой термостат желательно как можно реже открывать в процессе инкубирования.

Особенности культивирования аэробов, факультативных анаэробов, микроаэрофилов и капнофилов

В зависимости от отношения к молекулярному кислороду и СО₂ бактерии подразделяют на ряд групп.

Облигатные аэробы требуют для своего роста молекулярный кислород в количестве, соответствующем его концентрации в атмосфере (21%). Облигатные аэробы, требующие пониженных содержаний О₂, называют мик-роаэрофилами. Бактерии, у которых энергетический и конструктивный метаболизм протекают без молекулярного кислорода, называют облигатными анаэробами. Многие из облигатных анаэробов не только не нуждаются в молекулярном кислороде, но и не могут расти в его присутствии — строгие или аэрочувствительные анаэробы (виды родов Fusobacterium, Bacteroides), среди которых есть менее чувствительные (C. perfinges, C. sporogenes).

К анаэробам относят молочнокислые бактерии, но они могут расти в присутствии О₂ и получили название аэротолерантных анаэробов. Группу бактерий, которые могут в зависимости от наличия или отсутствия О₂ осуществлять брожение или дыхание, называют факультативными анаэробами.

Многие виды микроорганизмов (вообще или в первых генерациях) не могут размножатся без СО₂, например бруцеллы и т.п. Такие бактерии называют капнофилами. Оптимальная концентрация СО₂ обычно составляет около 5% (объем). Бактерии не усваивают собственно СО₂, а только ионы бикарбоната (НСО₃), образующиеся при растворении СО₂ в среде.

Вышеизложенные свойства определяют ряд особенностей культивирования бактерий перечисленных групп.

Аэробы и факультативные анаэробы, растущие в жидкой среде, первоначально потребность в кислороде обеспечивают за счет О₂, растворенного в среде, а затем источником является кислород, поступающий из воздуха. Однако О₂ отличается низкой растворимостью (около 8-9 мг/л) и при определенных условиях может стать лимитирующим фактором, как любой другой компонент питательной среды. Количество кислорода, потребляемое отдельной клеткой, наиболее велико в период лагфазы.

Диагностическое культивирование в жидких средах обычно проводят в бактериологических пробирках, реже в колбах. В пробирках обеспечивается только минимальная потребность аэробов в кислороде, в них удовлетворительно растут факультативные анаэробы.

Чтобы улучшить аэрацию растущей культуры, во-первых, необходимо увеличить площадь контакта воздуха и культуральной жидкости, например помещая пробирки в наклонном положении или уменьшая объем питательной среды. С другой стороны, в культуральный сосуд должен достаточно свободно поступать воздух, причем в стерильном состоянии, т.е. имеют значение характеристики пробки, закрывающей пробирку или колбу. Вата должна быть негигроскопичной, так как увлажненные пробки плохо пропускают воздух, вата в ватно-марлевых пробках не должна быть уложена слишком плотно, т.е. пробка не должна быть чрезмерно большой для пробирки или колбы. В колбах рекомендуется отверстие сосуда закрывать следующим образом: между двумя слоями марли кладут слой ваты, разрезают эту ватно-марлевую салфетку на квадраты, закрывают ими горло колбы и фиксируют резинками. Избыточная аэрация некоторых жидких сред при культивировании аэробов в ферментерах приводит к торможению их роста.

Выращивание микроаэрофилов проводят в специальных герметически закрывающихся термостатах, где уровень кислорода снижают до 5-6%. Обычно герметически закрывающийся термостат с манометром известного объема соединяют с баллоном, содержащим газ. После загрузки термостата посевами откачивают насосом необходимый объем воздуха, затем вентили перекрывают.

Наиболее доступным способом выращивания микроаэрофилов является способ культивирования в полужидком агаре (0,15-0,4%). Полужидкую питательную среду наливают в пробирки высоким столбиком. Кислород из воздуха диффундирует в толщу среды, и при этом создается его градиент с максимумом у поверхности и минимумом на дне пробирки. Материал или культуру засевают уколом вертикально. Микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности среды в виде тонкого диска в зоне оптимальной концентрации О₂. В конце роста зона помутнения становится более плотной и смещается ближе к поверхности среды.

При культивировании капнофильных бактерий используют ряд приемов.

- Чашки, пробирки с посевами помещают в анаэростат, откачивают из него необходимый объем воздуха, что контролируют по манометру, затем добавляют в анаэростат из любой емкости СО₂ до восстановления на манометре анаэростата атмосферного давления.

- Посевы помещают в эксикатор (пришлифованные поверхности и крышки смазывают вазелином), ставят в эксикатор горящую свечу и закрывают крышку. После того как свеча погаснет, концентрация СО₂ обычно составляет 2,5% и 17% — О₂.

- Химический способ. В эксикатор (анаэростат) вместе с посевами помещают склянку с 0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора Н₂SО₄ или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл соляной кислоты из расчета 100 мл объема сосуда Концентрацию СО₂ в атмосфере эксикатора можно определить следующим способом. В пробирку наливают 2-3 мл 0,1%-ного раствора бикарбоната натрия и 1-2 капли 0,5%-ного раствора бромтимолового синего. Цвет смеси в зависимости от концентрации СО₂ в атмосфере меняется следующим образом: синий –