Методические рекомендации по постановке тестов ингибирования роста бактерий, выделенных в ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/131)

Методические рекомендации подготовили: А.Э. Высоцкий, А.П. Лысенко, З.Н. Барановская, И.И. Румачик, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, С.А.

Общие положения

Настоящие Методические рекомендации определяют порядок постановки тестов ингибирования роста бактерий, выделенных в ветеринарных лабораториях научно-исследовательских организаций и высших учебных заведений ветеринарного профиля при диагностике болезней животных (включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел).

При идентификации микроорганизмов тесты ингибиции используют широко. Наиболее часто устанавливают определение способности к росту в средах с антибиотиками, различным содержанием натрия хлорида, уровнями рН, температуры и т.д.

Определение чувствительности к антибиотикам

Антибиотики подавляют ряд метаболических функций микроорганизмов. Чувствительность бактерий к антибиотикам отражает существенные особенности их метаболизма и используется как таксономический признак при идентификации.

Метод диффузии в агар В стандартные чашки Петри наливают 15 мл 2%-ного агара Хоттингера рН 7,0-7,4 (перевар с 110-130 мг% аминного азота). Питательную среду подсушивают с приоткрытыми крышками 30 минут при 37° С. На поверхность агара наносят 1 мл суспензии испытуемой '24-часовой культуры бактерий (2 млрд/мл) и равномерно распределяют, избыток суспензии отсасывают пипеткой. Затем на агар при помощи пинцета помещают диски, пропитанные антибиотиками, на расстоянии 2,5 см от центра чашки (5-6 дисков на 1 чашку Петри). Посевы инкубируют при 37^оС 16-18 ч и измеряют зоны задержки роста бактерий около дисков (включая диаметр дисков). Результаты оценивают по следующей схеме: диаметр зоны задержки роста 15-25 мм и более — микроорганизм чувствителен и высокочувствителен, зона 11-15 мм — умеренно чувствителен, зона менее 10 мм или задержки роста нет — устойчив.

Метод серийных разведений антибиотиков Отличается большей точностью. Питательную среду (МПБ, бульон Хоттингера, рН 7,2-7,4) разливают по 2 мл в пробирки (обычно готовят 8-10 и более пробирок на каждый антибиотик). В первую пробирку добавляют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации и готовят его последовательные двукратные разведения. Для каждого разведения используют новую пипетку. Из предпоследней пробирки 2 мл жидкости удаляют. Последняя пробирка без антибиотика служит контролем. Затем в каждую пробирку вносят по 2 мл суспензии бактерий концентрацией от 100 тысяч до 1 млн. микробных клеток в 1 мл. Посевы инкубируют при 37° С 18-24 ч.

Минимальную, подавляющую рост микроорганизма концентрацию антибиотика определяют путем сложения концентрации антибиотика в двух соседних пробирках, в одной из которых есть рост микроорганизма, а в другой его нет с последующим делением пополам.

Для работы готовят основные и рабочие растворы антибиотиков. Основной раствор содержит 1000 мкг антибиотика в 1 мл. Используют стандарты антибиотиков с указанием числа единиц или мкг в 1 кг препарата. Основные растворы должны содержать 1 мг антибиотика в 1 мл. Тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин растворяют в 0,01N растворе соляной кислоты; олеандомицин, стрептомицин, левомицетин, полимиксинсульфат — в фосфатном буфере с рН 6,8-7,0; эритромицин — в буфере с рН 7,8-8,0. Неомицин и мономицин готовят в дистиллированной воде с рН 6,0-6,2. Эритромицин и левомицетин предварительно растворяют в 96%-ном этаноле, а затем в фосфатном буфере. Срок пригодности растворов (хранение при 4-6° С): тетрациклин, олеандомицин, эритромицин — 7 суток, неомицин, мономицин — 15, а стрептомицин, левомицетин и полимиксин — 30 суток.

Патогенные бактерии в настоящее время считают устойчивыми, если они растут при следующих концентрациях антибиотиков: пеницилин и эритромицин — 10 ЕД, окситетрациклин, хлортетрациклин, тетрациклин, неомицин, мономицин, левомицетин — 20, стрептомицин и полимиксин — 50 мкг и более.

Таблица 1

Фосфатные буферные смеси для растворения антибиотиков

Чувствительность к бацитрацину Стерильные бумажные диски пропитывают 0,04 ЕД бацитрацина. Испытуемую культуру засевают газоном на кровяной агар в чашках Петри и на поверхности среды помещают диск с бацитрацином. Посевы инкубируют 24 часа. Положительный результат — стерильная зона вокруг диска.

Определение чувствительности к 2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридинфосфату

Культуру бактерий засевают газоном на поверхность питательного агара в чашках Петри, затем на поверхность среды помещают стерильный диск (6-8 мм) фильтровальной бумаги, пропитанный раствором 2,4-диамино-6,7-ди-изопропилптеридинфосфата (0,1 г препарата в 100 мл ацетона). После инкубирования посевов учитывают результат. В положительных случаях вокруг дисков обнаруживается зона ингибиции роста бактерий.

Определение устойчивости к желчи

Метод 1. Испытуемую культуру бактерий засевают штрихом на агар с желчью в чашках Петри, инкубируют при оптимальной температуре. Результат оценивают по наличию или отсутствию роста бактерий на питательных средах с различным содержанием желчи.

Приготовление агара. В мясопептонный агар (рН 7,2-7,4) добавляют необходимое количество дегидратированной желчи крупного рогатого скота. Реакцию среды вновь доводят до исходной и стерилизуют автоклавированием при 112° С 15 минут. Стерильный агар остужают до 45-50° С, добавляют 0,5% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота и разливают по чашкам Петри (1% дегидратированной желчи равен по объему 10% жидкой, поэтому, например, для получения 40%-ного желчного агара к питательной среде необходимо добавить 4% дегидратированной желчи).

Может быть использована для приготовления 10%-ного желчного агара нативная желчь крупного рогатого скота. С этой целью от здоровых животных на мясокомбинате собирают желчь, прогревают ее 1 ч текучим паром, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют текучим паром, 3 дня по 30 минут.

Наряду с желчным агаром для определения чувствительности микроорганизма к желчи может быть использован желчный бульон (рН 7,2-7,5) с нативной (10-20%) или дегидратированной желчью (1-2%).

Метод 2. Используют для изучения анаэробных бактерий. Культуру микроорганизма засевают в пептонно-дрожжевой бульон с желчью и без желчи. Посевы культивируют, пропуская через бульон очищенную от кислорода СО₂ и сравнивают результаты роста в обеих пробирках.

Состав пептонно-дрожжевой среды для выращивания анаэробов: пептон — 5 г, триптиказа — 5 г, дрожжевой экстракт (сухой) — 10 г, 0,25%-ный резазурин — 4 мл, солевой раствор — 40 мл, раствор гемина —10 мл, раствор витамина К₁ — 0,2 мл, цистеин НС1 — 0,5 г, вода дистиллированная — 1000 мл.

Солевой раствор. В 300 мл дистиллированной воды растворяют 0,2 г СаС1₂ (безводный) и 0,48 г МgSO₄·7Н₂0. Затем вливают 500 мл дистиллированной воды и добавляют 1 г К₂НРO₄, 10 г NаНСО₃ и 2 г NаС1. После растворения солей добавляют еще 200 мл дистиллированной воды.

Раствор гемина. В 1 мл 1N раствора NаОН растворяют 0,05 г гемина, добавляют до 100 мл дистиллированную воду и стерилизуют автоклавированием при 12° С 15 минут.

Раствор витамина К₁: в 30 мл 95%-ного этанола растворяют 0,15 мл витамина К₁.

К основной стерильной питательной среде асептически добавляют 2% (по объему) желчи крупного рогатого скота и стерильный раствор глюкозы до конечной концентрации 1% по сухому веществу.

Определение литического действия желчи на бактерии

Испытуемую культуру выращивают 24 ч в бульоне Тедда-Хевита, центрифугируют, осадок клеток суспензируют в 0,5 мл 0,067 М фосфатного буфера, добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора натрия дезоксихолата.

Бульон Тедда—Хевита: экстракт из сердца быка — 1000 мл, пептон — 20 г. Компоненты смешивают, устанавливают рН 7,0 и добавляют NaС1 — 2 г, NаНСO₃ — 2 г, NаНРO₄ — 0,4 г, глюкозы — 2г. После растворения компонентов устанавливают рН 7,8, смесь кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 10 минут.

Способность бактерий к росту на агаре Мак-Конки

Ряд первичных дифференциальных сред, используемых для выделения энтеробактерий, обладает селективными свойствами. Кроме своего прямого назначения, в некоторых случаях их применяют для дифференциации бактерий других групп, которые растут или не растут на указанных питательных средах.

Агар Мак-Конки: казеиновый пептон —17 г, мясной пептон — 3 г, лактоза – 10 г, натрия дезоксихолат — 1,5 г, натрия хлорид — 5,0 г, агар – 17 г, 1%-ный водный раствор нейтральрота — 3 мл, 1%-ный водный раствор кристаллвиолета — 1 мл, вода дистиллированная —1000 мл. Компоненты растворяют в дистиллированной воде (кроме индикатора), кипятят, фильтруют, добавляют индикатор и 20 минут автоклавируют (или дробно стерилизуют). Конечный рН 7,1. Разливают в чашки Петри по 20 мл. Среда должна быть прозрачной, розовой со слегка фиолетовым оттенком. Лактозопозитивные бактерии образуют колонии розового цвета.

Ингибиция роста бактерий калия цианидом

Тест применяется для дифференциации энтеробактарий. Например, эшерихии не способны расти в присутствии калия цианида.

Испытуемую культуру засевают в жидкую питательную среду с цианидом калия, инкубируют 24-48 ч. Обязательно наличие контрольной пробирки без калия цианида (КСN). Положительный результат — отсутствие роста (среда прозрачна), отрицательный результат — рост есть (среда мутнеет).

Состав среды: пептон — 10 г, NaС1 — 5 г, КН₂РO₄ — 0,225 г, Ка₂НРO₄·2Н₂0 — 5,64 г, вода дистиллированная —1000 мл, 0,5%-ный водный раствор КСN —15 мл.

В дистиллированной воде растворяют соли, пептон и раствор КСN, устанавливают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр, разливают и стерилизуют.

Чувствительность к оптохину

Исследуемую культуру засевают газоном на агаровую питательную среду в чашках Петри. Затем на поверхность среды помещают стерильный диск из фильтровальной бумаги, пропитанный 0,02 мл 0,025%-ного раствора оптохина (гидрохлорид этилгидрокупреина). Посевы инкубируют 24-48 ч при 37-38°С. Положительная реакция — зона задержки роста бактерий вокруг диска.

Методические указания по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 17.12.2007 (№ 10-2-5/1112)

Методические указания подготовили: А.Э. Высоцкий, Г.Е. Толяронок, А.П. Курдеко, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, З.Н. Барановская

1 Общие положения

1.1 Одним из основных элементов рационального применения антибиотиков и антибактериальных препаратов в ветеринарии для лечения инфекционных болезней является определение чувствительности возбудителя болезни к этим антибиотикам. Это необходимо для того, чтобы избрать наиболее эффективный препарат (антибиотик) из числа рекомендованных при данном заболевании и для своевременной замены применяемого в животноводстве антибиотика другим, при установлении резистентности к нему патогенных микроорганизмов.

1.2 Систематическое определение уровня чувствительности возбудителей инфекционных болезней к антибиотикам позволяет прогнозировать результативность антибиотикотерапии в конкретных хозяйствах и зонах.

1.3 Установленная диагностической ветеринарной лабораторией чувствительность патогенных микроорганизмов к антибиотику позволяет применять этот препарат для лечения животных в течение 1-2 месяцев. При отсутствии терапевтического эффекта и уточнения диагноза определение чувствительности культур возбудителя болезни следует повторить независимо от длительности применения антибиотика в хозяйстве.

1.4 Чувствительность микроорганизмов к антибиотику дает основание использовать для лечения другие антибиотики одноименной группы. Например, возбудитель болезни, чувствительный к окситетрациклину, будет чувствителен и к хлортетрациклину, тетрациклину, биоветину и другим тетрациклиновым препаратам.

1.5 Среди микроорганизмов отмечают перекрестную устойчивость к антибиотикам, родственным по химической структуре. Возбудитель болезни, устойчивый к пенициллину, чаще резистентен и к бициллину, феноксиметилпенициллину и другим препаратам этой группы, за исключением синтетических и полусинтетических пенициллинов.

1.6 Чувствительность микроорганизмов определяют минимальной концентрацией антибиотика (мкг, ЕД/мл), которая задерживает рост или убивает их в течение 16-18 часов. Для этой цели обычно используют два наиболее распространенных метода:

- метод серийных разведений на жидкой или плотной питательной среде;

- метод диффузии в агар с применением дисков, содержащих антибиотики.

1.7 При определении чувствительности патогенных микроорганизмов к антибиотикам необходимо соблюдать следующие основные условия:

- определять чувствительность возбудителя болезни к тем антибиотикам, которые рекомендованы при этом заболевании;

- использовать 3-10 колоний чистой культуры каждого вида микроорганизмов в отдельности, выделенных из патологического материала;

- применять стандартные питательные среды, одинаковые по составу, проценту агара, аминного азота, рН (общепринятая в бактериологической практике агаровая среда – АГВ);

- антибиотики, диски, количество посевного материала (микробных клеток), контрольные тест-культуры должны отвечать стандартам;

- плотно закрывать и парафинировать вскрытые ампулы и флаконы после извлечения части антибиотиков или дисков;

- для контроля определения чувствительности испытуемых микробов и проверки новых партий питательных сред параллельные исследования вести с соответствующими для каждого антибиотика тест-микробами, чувствительность которых указана в таблице 1;

- при выявлении устойчивых штаммов методом диффузии в агар с применением дисков заключительное исследование проводить методом серийных разведений.

Таблица 1

Чувствительность эталонных тест-микробов к антибиотикам в МПБ (рН 7,2-7,4)

2 Метод серийных разведений

2.1 Основные элементы метода:

- выбор питательных сред;

- приготовление растворов антибиотиков;

- подготовка культур для исследования;

- учет результатов.

2.2 Выбор питательных сред. Состав питательной среды выбирают в зависимости от вида испытуемых микроорганизмов и метода, используемого при определении чувствительности. Среда должна обеспечивать оптимальный рост культуры. В основном следует применять следующие питательные среды:

а) жидкие питательные среды для аэробных бактерий:

- мясо-пептонный бульон (рН 7,2-7,4);

- бульон Хоттингера с содержанием 180-200 мг% аминного азота (рН 7,4-7,6).

б) Стандартная плотная питательная среда для аэробных бактерий – АГВ (рН 7,2-7,4).

При слабой интенсивной роста микроорганизмов в среду необходимо добавить 10% стерильной сыворотки крови лошади (сыворотку перед применением инактивируют в течение 30 минут при температуре 56^оС), 0,5% дрожжевого экстракта и 1% глюкозы.

в) Для анаэробных бактерий готовят среду Китта-Тароцци без кусочков печени с добавлением 0,5% глюкозы (рН 7,4-7,6), которую перед исследованием следует прокипятить 5-10 минут и быстро охладить.

2.2.1 Для каждого штамма микроорганизмов, при определении чувствительности к одному антибиотику, необходимо: 6 пробирок с питательной средой по 2 мл (для анаэробов по 9 мл) для серийного разведения антибиотика, две пробирки по 9-10 мл питательной среды для разведения культуры и питательная среда в колбе для приготовления рабочего раствора антибиотика.

2.3 Приготовление растворов антибиотиков. Применяют два раствора — основной и рабочий. Для приготовления их используют стандарты антибиотиков с определенной активностью, согласно действующим ТНПА.

2.3.1 Основной раствор готовят из расчета 1000 мкг (ЕД) антибиотика в 1 мл растворителя. При определении чувствительности анаэробных микроорганизмов или при использовании в работе агаровой среды основной раствор готовят из расчета 10000 ЕД/мл.

2.3.1.1 Навеску стандарта антибиотика (не менее 10 мг) взвешивают в стерильных бюксах на аналитических весах и растворяют. В таблице 2 указаны растворители и сроки хранения основных растворов антибиотиков.

Таблица 2

Растворители и сроки хранения основных растворов антибиотиков

2.3.1.2 Приготовление фосфатных буферных растворов приведено в таблице 3.

Таблица 3

Приготовление фосфатных буферных растворов

Буферные растворы стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атм (110-112^оС) в течение 30 минут.

2.3.1.3 Навески стандартов (например, эритромицина и левомицетина) предварительно растворяют в 96° этиловом спирте из расчета 10 мг антибиотика на 1 мл спирта, затем добавляют соответствующий фосфатный буфер до нужного объема.

2.3.1.4 Основные растворы можно готовить и на дистиллированной воде, которые хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой при температуре 2-8°С и используют не более 3-15 дней.

Например: приготовление основного раствора эритромицина с концентрацией 1000 мкг/мл.

Навеска стандарта эритромицина составила 18,5 мг. Зная активность антибиотика (940 ЕД в 1 мг), определяем общее количество действующего начала в навеске (ЕД или мкг): 940 ЕДх18,5= 17390 ЕД. Для получения раствора с содержанием 1000 мкг/мл растворителя необходимо — 17390:1000 = 17,4 мл. Вначале в бюкс наливают 2 мл этилового спирта. После растворения эритромицина добавляют 15,4 мл фосфатного буфера.

2.3.2 Рабочие растворы по активности должны быть приближены к ожидаемой чувствительности исследуемых культур. Их готовят из основного раствора непосредственно перед опытом, применяя для разведения питательную среду. При этом необходимо учитывать используемый метод, количество штаммов, подлежащих исследованию, и предполагаемую чувствительность микроорганизмов. В таблице приложения приведены показатели предполагаемой чувствительности к 9 антибиотикам 18 видов патогенных для животных микроорганизмов.

2.3.2.1 Приготовление рабочего раствора для исследования чувствительности аэробных микроорганизмов на жидкой питательной среде

Растворы антибиотиков готовят в пробирках методом последовательных серийных разведений с таким расчетом, чтобы предполагаемая чувствительность культуры приходилась на середину ряда. С этой целью исходный рабочий раствор готовят в объеме достаточном, чтобы добавить по 2 мл в первую пробирку каждого ряда, взятых по числу исследуемых культур. Концентрация антибиотика в этом растворе должна быть в два раза выше концентрации, намеченной для первой пробирки ряда В случае, если чувствительность культур, взятых для определения, находится в пределах 0,01-0,1 мкг/мл, для получения необходимой концентрации антибиотика вначале в пробирках и колбе готовят стерильный рабочий раствор с активностью 0,5 мкг/мл.

В первую пробирку ряда, в котором предварительно была разлита питательная среда по 2 мл, вносят из колбы 2 мл рабочего раствора антибиотика с концентрацией 0,5 мкг/мл. Содержимое пробирки тщательно перемешивают. Из первой пробирки 2 мл среды с антибиотиком переносят во вторую, из второй 2 мл в третью и так до последней пробирки ряда. Таким образом, будет получена питательная среда с концентрацией 0,25; 0,12; 0,06; 0,03; 0,015; 0,007 мкг антибиотика в 1 мл.

Рабочие растворы антибиотиков готовят для определения чувствительности салмонелл и кишечных палочек на мясо-пептонном бульоне; для возбудителей рожи, пастереллеза, листериоза — на бульоне Хоттингера.

2.3.2.2 Приготовление рабочих растворов для исследования чувствительности аэробных микроорганизмов на плотной питательной среде.

Для получения соответствующих рабочих разведений одного антибиотика берут 6 стерильных пробирок и 6 бактериологических чашек. Предполагаемая чувствительность штаммов 2-4 мкг/мл. В этом случае следует взять 6 чашек, содержащих 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,6 мкг/мл антибиотика. Учитывая, что общий объем питательной среды в чашке будет составлять 20 мл, в первую чашку нужно добавить 1 мл МПБ, содержащего 400 мкг/мл антибиотика.

Для приготовления рабочих растворов берут одну пробирку с 2,4 мл и пять пробирок, содержащих по 2 мл МПБ или дистиллированной воды.

Из основного раствора активностью 1000 мкг/мл отмеряют 1,6 мл (1600 мкг) и вносят в первую пробирку с 2,4 мл растворителя, в которой, таким образом, концентрация будет доведена до 400 мкг/мл. Из этой пробирки 2 мл переносят во вторую, 2 мл из второй в третью и так далее. Количество антибиотика в пробирках будет составлять 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 мкг/мл. Из каждой пробирки, начиная с меньшего разведения, берут по 1 мл, вносят в соответствующую чашку и добавляют из колбы 19 мл расплавленной (55-65°С) агаровой среды. Содержимое вращательным движением смешивают и оставляют остывать. Концентрация антибиотика в бактериологических чашках будет в 20 раз ниже, чем в МПБ пробирок, в которых предварительно разводили антибиотик.

2.3.2.3 Приготовление рабочих растворов для исследования чувствительности анаэробных микроорганизмов.

Рабочие растворы антибиотиков готовят на среде Китт-Тароцци без кусочков печени и масла в пробирках или небольших колбах, число которых должно соответствовать числу пробирок ряда, взятого для каждого штамма.

После разведения антибиотика из этих пробирок или колб по 1 мл среды вносят в соответствующие пробирки опыта, начиная с меньших концентраций препарата, и содержимое перемешивают.

2.4 Подготовка культур для исследования. В зависимости от вида микроорганизма для посева используют 16-18-часовую бульонную или агаровую культуру. В ряды пробирок или бактериологических чашек с питательной средой, содержащей соответствующие разведения антибиотиков, испытуемую культуру засевают мерной (полуавтоматической) пипеткой или бактериологической петлей.

2.4.1 При определении чувствительности методом серийных разведений на жидкой питательной среде салмонелл, кишечных палочек, стафилококков, стрептококков и ряда других микроорганизмов используют агаровые культуры, которые смывают стерильным 0,9%-ным водным раствором натрия хлорида (изотонический раствор). По стандарту мутности (10 ед. МОС) определяют концентрацию микробных клеток в 1 мл, затем методом последовательных разведений (10^-3) получают концентрацию 1 млн. микробных клеток в 1 мл. Для этой цели разведение культур проводят в двух пробирках с питательной средой. В первую пробирку, содержащую 10 мл, вносят 0,1 мл культуры с концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1 мл, содержимое перемешивают и 1 мл переносят во вторую пробирку с 9 мл питательной среды, из которой по 0,2 мл высевают в каждую пробирку ряда и дополнительно на МПА без антибиотика для контроля чистоты культуры. Пробирку, из которой проводили посев, используют для контроля качества питательной среды. В рабочих пробирках концентрация культуры будет составлять 100 тыс. микробных клеток в 1 мл среды.

2.4.2 При определении чувствительности методом серийных разведений на жидкой питательной среде возбудителей рожи, пастереллеза, листериоза используют культуры, выращенные на бульоне Хоттингера, которые перед посевом разводят 1:10000. Это разведение получают последовательно в двух пробирках, содержащих по 10 мл питательной среды. В первую пробирку вносят 0,1 мл бульонной культуры, содержимое перемешивают и 0,1 мл переносят во вторую пробирку, из которой высевают по 0,2 мл в каждую пробирку ряда.

2.4.3 Определение чувствительности аэробных микроорганизмов в агаровой среде проводят в бактериологических чашках, дно которых предварительно делят на сегменты и номеруют по числу исследуемых культур (до 10 штаммов).

Испытуемые культуры засевают петлей — агаровые смывают и разводят до концентрации 500 млн. микробных клеток в 1 мл, бульонные культуры возбудителей ролей, пастереллеза и др. наносят на агар неразведенными. Перед посевом чашки подсушивают в термостате в течение 30 минут.

2.4.4 При определении чувствительности анаэробных микроорганизмов для засева среды с антибиотиком используют неразведенную суточную культуру, выращенную на среде Китт-Тароцци с кусочками печени, которую вносят в количестве 0,2 мл на пробирку. Штаммы анаэробов перед посевом разводят 1:100 в питательной среде.

2.4.5 При определении спектра действия новых антибиотиков используют концентрацию культуры 1000 микробных клеток в 1 мл питательной среды. Для выявления устойчивых штаммов берут большее количество микробных клеток (100 тыс.), что увеличивает вероятность внесения в среду резистентных особей.

2.5 Результаты определения чувствительности к антибиотикам аэробных и анаэробных бактерий учитывают визуально через 16-18 часов инкубации при 37°С. Отмечают пробирку или чашку, в которой отсутствует рост. Показатель концентрации антибиотика в ней складывают с количеством антибиотика в последующей пробирке, где отмечен рост культуры, и выводят среднее арифметическое число, которое показывает чувствительность испытуемого штамма к антибиотику. Так, в пробирке с содержанием антибиотика 2,5 мкг/мл нет роста, а в следующей, где концентрация препарата 1,25 мкг\мл, установлен рост культуры, в этом случае бактериостатическая концентрация будет соответствовать 1,8 мкг/мл.

2.5.1 Если среда помутнела во всех пробирках, то это указывает, что испытуемый микроб устойчив к максимально взятой концентрации антибиотика. Отсутствие роста во всех пробирках свидетельствует о том, что чувствительность микроба выше использованной в опыте минимальной концентрации. Исследование повторяют с другими концентрациями антибиотика.

2.5.2 Если рост культур отдельных видов микробов появляется в более поздние сроки, то и результаты по чувствительности учитывают в соответствии с особенностями их роста.

2.5.3 При оценке результатов определения чувствительности микробов к антибиотикам следует учитывать материал, из которого выделена культура.

2.5.4 Патогенные микроорганизмы, выделенные из крови и паренхиматозных органов, считают резистентными в том случае, если рост их не подавляется антибиотиками в концентрациях, указанных в таблице 4.

Таблица 4

Резистентность микроорганизмов к антибиотикам

2.5.5 Чувствительность к антибиотикам микроорганизмов, выделенных из материала, взятого из ран, вымени, мочеполового тракта, может быть ниже, чем указано в таблице 3, поэтому выбор лекарственных форм антибиотиков должен соответствовать полученным показателям чувствительности.

3 Метод диффузии в агар с применением дисков, содержащих антибиотики

3.1 Питательные среды:

Стандартная плотная питательная среда для аэробных бактерий – АГВ (рН 7,2-7,4).

При слабой интенсивной роста микроорганизмов в среду необходимо добавить 10% стерильной сыворотки крови лошади (сыворотку перед применением инактивируют в течение 30 минут при температуре 56^оС), 0,5% дрожжевого экстракта и 1% глюкозы.

3.1.1 Среду разливают по 20 мл в стерильные бактериологические чашки.

3.2 Исследуемые культуры, выращенные на агаровой среде, смывают стерильным 0,9%-ным водным раствором натрия хлорида и по бактериальному стандарту мутности (10 ед. МОС) готовят взвесь. На поверхность застывшей среды наливают 1 мл взвеси культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности. Излишек жидкости отсасывают пипеткой. Чашки подсушивают при 37°С в течение 15-30 минут.

3.3 Диски с антибиотиками (диаметр 6,5 и 8 мм) равномерно раскладывают стерильным пинцетом на расстоянии 2 см от края чашки и слегка прижимают к агару. Расстояние между дисками должно быть не менее 3 см. После окончания наложения дисков с одним антибиотиком пинцет протирают тампоном, смоченным этиловым спиртом, обжигают и приступают к раскладыванию дисков с другим антибиотиком.

3.3.1 Каждая чашка может служить для испытания активности 4-5 антибиотиков.

3.3.2 Нельзя допускать длительные интервалы (более 45 минут) между посевом культуры и наложением дисков.

3.3.3 Чашки с дисками для лучшей диффузии антибиотика в агар выдерживают в течение 2 часов при комнатной температуре (не выше 20°С), а затем помещают в термостат при температуре 37°С вверх дном.

Стандартные диски с антибиотиками, выпускаются биологической промышленностью, хранят их в закрытых флаконах, в сухом месте при комнатной температуре, срок годности указан на этикетке производителя.

3.4 Результаты учитывают через 16-18 часов с помощью линейки или миллиметровой бумаги. Определяют диаметр зон задержки роста микробов вокруг бумажных дисков, включая и диаметр дисков.

3.4.1 При использовании стандартных дисков диаметром 6,5 мм чувствительными микроорганизмами считаются образующие зону задержки роста 15 мм и более; при диаметре дисков 8 мм – с зоной задержки роста 18 мм и более.

3.4.2 К длительно применяемым препаратам у микроорганизмов развивается устойчивость и изменяются зоны задержки роста, поэтому производители дисков периодически предлагают новую интерпретацию чувствительности (таблица 5).

Таблица 5

Интерпретация результатов по определению чувствительности (резистентности) микроорганизмов к антибиотикам

3.5 При установлении резистентных культур возбудителей инфекционных болезней животных к применяемым в хозяйстве антибиотикам следует немедленно эти препараты заменять другими лечебными средствами.

3.6 В случае высокой устойчивости микроорганизмов к большинству исследованных антибиотиков целесообразно рекомендовать для терапии комплексное их применение, при этом необходимо учитывать их синергизм, потенцирование и совместимость (таблица 6).

Таблица 6

Комбинированное применение противомикробных препаратов (по А. Б. Черномордику, 1983)

Условные обозначения: +++ и ++ сочетание рекомендуется; + допустимо; + маложелательно; — недопустимо

Примечание. I. Не рекомендуется смешивать с другими препаратами. 2. Признается не всеми авторами.

Приложение

Таблица

Чувствительность к антибиотикам некоторых патогенных микроорганизмов