Методические указания по контролю санитарно-бактериологического состояния объектов ветеринарно-санитарного надзора
Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/121)
Методические указания подготовили: А.А. Вербицкий, И.А. Даровских, С.В. Даровских, А.Э. Высоцкий, И.В. Фомченко
1. Общие положения
1.1 Объектами ветеринарно-санитарного надзора являются организации осуществляющие убой и переработку мяса сельскохозяйственных животных и птиц, инкубационно-птицеводческие станции, станций и пункты искусственного осеменения, молочно-товарные фермы, кормокухни, рынки.
Санитарное состояние данных объектов оценивают визуально и по результатам санитарно-бактериологических исследований поверхностей оборудования, установок, тары и различных инструментов.1.2 Санитарно-бактериологический контроль является ценным вспомогательным методом при проведении ветеринарно-санитарного обследования предприятия, дающий возможность объективно оценить уровень санитарного состояния объектов подлежащих ветеринарному надзору.
1.3 Визуальный контроль санитарного состояния инвентаря и оборудования проводится ежедневно специалистами, отвечающими за санитарное состояние данного объекта. При контроле санитарного состояния оборудования, в первую очередь, обращают внимание, на участки труднодоступные для санитарной обработки.
1.4 Бактериологический контроль санитарного состояния объектов ветеринарного надзора осуществляют ветеринарные и производственные лаборатории путём исследования смывов на следующие показатели:
- количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, кое/см2 (КМАФАнМ);
- бактерии группы кишечной палочки (БГКП);
- коли-титр;
- патогенные, в том числе сальмонеллы;
- бактерии рода Proteus.
1.5 Периодичность исследований и нормативные показатели при контроле санитарного состояния объектов ветеринарного надзора изложены в «Ветеринарно-санитарных правилах по мойке и дезинфекции технологического оборудования и производственных помещений для организаций, осуществляющих убой сельскохозяйственных животных и переработку мяса.
Утверждены постановлением Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь от 8 ноября 2007 г.».2. Отбор проб для исследования
2.1 Смывы осуществляют ветеринарные врачи государственных ветеринарных учреждений в присутствии представителя предприятия или организации без предварительного оповещения.
2.2 Смывы с технологического оборудования, аппаратуры производственных цехов, тары, инвентаря, санитарной одежды персонала, а также с инструментов, применяемых в работе, берут с поверхностей подвергшихся санитарной обработке, т.е. смывы отбирают с чистых объектов (перед началом смены). Количество отбираемых смывов зависит от особенностей технологического процесса, количества исследуемых объектов.
2.3 При взятии смывов с оборудования и инвентаря, записывается: номер образца по порядку, место взятия смыва. Составляется акт о взятии смывов в 2-х экземплярах, подписывается лицом, отобравшим пробы, и представителем администрации предприятия. 1 экземпляр акта оставляется на объекте. Результаты исследования доводятся до сведения руководителя предприятия в течение 5 дней.
2.4 Время доставки смывов в лабораторию для проведения исследования не должно превышать 4-х часов, так как затягивание этого срока отражается на достоверности результатов анализа.
2.5 Тампоны делают на металлических стержнях или деревянных палочках длиной 18-20 см, пропущенных через ватно-марлевую, корковую или резиновую пробку. Смонтированные тампоны, помещают в пробирки, закрывают их пробками и стерилизуют при 120°С в течение 30 минут.
Марлевые салфетки размером 5x5 см завертывают по одной штуке в бумажные пакеты и стерилизуют при 120°С в течение 30 минут. Затем в каждую пробирку с тампоном наливают по 2 мл стерильного физиологического раствора, так чтобы ватный тампон находился в 2-3 см над поверхностью жидкости.
2.6 Непосредственно перед взятием смывов тампоны или салфетки увлажняют. Для этого салфетки берут пинцетом, прокаленным над пламенем горелки, и опускают в пробирки с 2 мл физиологического раствора, a тампоны погружают в жидкость, наклоняя пробирки.
Избыток влаги отжимают о внутреннюю стенку пробирки.2.7 Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности 100 см2, для ограничения поверхностей используют шаблон (трафарет), сделанный из проволоки, металлической пластинки и т.д. Трафарет имеет площадь 25 см2, чтобы взять смывы с площади в 100 см2, его накладывают 4 раза в разных местах поверхности контролируемого объекта. Допускается использовать трафарет площадью 100 см2. Перед использованием трафарет прожигают над пламенем горелки.
2.8 Для оценки санитарного состояния инструмента, используемого на госплемпредприятиях, станциях и пунктах искусственного осеменения, смывы берут с сосудов Дьюара, влагалищных зеркал, корнцангов, шприцов-катетеров, ножниц, штативов, подставок для инструментов, измерительных цилиндров и мензурок, воронок, перчаток и с других инструментов, используемых в работе.
2.9 На инкубационно-птицеводческих станциях, птицефабриках смывы берут с инкубационного яйца, контейнеров, используемых для перевозки яиц, конвейерных лент, лотков для яиц закладываемых в инкубаторы и выводные шкафы, с внутренней поверхности инкубаторов и выводных шкафов, сортировочных столиков, шприцов-автоматов.
2.10 На рынке смывы берут с прилавков, рубочных колод, разрубочных досок, посуды используемой для хранения, доставки и продажи пищевых продуктов и различных инструментов, соприкасающихся с пищевыми продуктами.
2.11 Контроль санитарного состояния доильного оборудования и молочной посуды осуществляют путем визуального осмотра и бактериологических исследований смывов с их рабочих поверхностей. Визуальный контроль санитарного состояния молочного оборудования осуществляет бригадир данной фермы ежедневно в периоды между доениями коров.
При визуальном контроле санитарного состояния молочного оборудования в первую очередь обращают внимание на участки поверхности, труднодоступные для мойки: в доильных аппаратах, внутренняя поверхность головки сосковой резины, внутренняя поверхность коллектора и штуцеров, молочных трубок и шлангов, под уплотнительной прокладкой крышки ведра.
На доильных установках, кроме указанных деталей доильных аппаратов, осматривают внутренние поверхности молокопроводов, воздухоразделителя молочного насоса, фильтра и резиновых шлангов. Чистоту резиновых шлангов и непрозрачных трубопроводов проверяют путем пробного протирания их внутренних поверхностей ершом с удлиненной ручкой.
При наличии на поверхности оборудования видимых следов молочных остатков, слизистых или минерализованных отложений ("молочный камень") или неприятного запаха санитарное состояние оценивается как неудовлетворительное. Такое оборудование к использованию не допускается до полного удаления указанных загрязнений.
Взятие смывов производят перед очередным доением стерильными ватными тампонами путем 2-кратного протирания во взаимно перпендикулярных направлениях со 100 см2 площади обследуемого объекта. Смывы с некоторых узлов доильных аппаратов берут без учета площади - со всей поверхности коллектора или на длину держателя тампона при обследовании трубопроводов, резиновых шлангов и сосковой резины.
Для выделения патогенной микрофлоры допускается взятие смывов с инвентаря, некоторых узлов оборудования, мелких предметов без учёта площади, с любого места поверхности, а при исследовании трудно доступных мест (шлангов, трубопроводов и т.д.) тампон продвигают на всю длину его держателя, делая вращательные движения.
2.12 При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см2 - нижнюю часть каждого рукава и 2 площадки с верхней и средней частей передних пол спецовки.
3. Подготовка проб и проведение исследований
3.1 Приготовление разведений.
Для разведений и дальнейших исследований применяют только стерильный физиологический раствор и лабораторную посуду.
3.1.1 После доставки проб в лабораторию в пробирку с тампоном, в которой имеется 2 мл жидкости, вносят ещё 8 мл физиологического раствора и тампон или салфетку в течение 2-3 мин тщательно отмывают, затем отжимают и удаляют. Полученное разведение считают исходным.
Из исходного разведения в стерильных условиях, готовят последовательные десятикратные разведения. Для этого берут ряд пробирок (обычно не более 5-ти), каждая пробирка должна содержать 9,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку стерильной градуированной пипеткой вносят1,0 мл исходного разведения, затем новой стерильной пипеткой после весьма тщательного перемешивания содержимое 1-й пробирки в количестве 1 мл переносят в следующую пробирку, не прикасаясь к поверхности жидкости в этой пробирке и т.д. Из каждой пробы делают посев глубинным методом на 2 параллельные чашки Петри из 2-3 последовательных разведений в количестве 1,0 мл. Чашки заливают расплавленным и остуженным до 450С агаром сразу же после внесения материала. В противном случае может наблюдаться неравномерное распределение колоний в виде отдельных скоплений в толще агара. Для более равномерного распределения посевного материала, кроме того, содержимое чашки перемешивают вращательными движениями.3.1.2 После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат дном вверх, инкубируют при 30+1 0C в течение 72 часов. Количество колоний подсчитывается на каждой из засеянных чашек. Счет колоний на чашках производят с помощью прибора для счета колоний бактерий или лупы. Для лучшей видимости считают колонии на темном фоне (под чашку кладут темную бумагу), чашки помещают дном кверху. Каждую колонию отмечают на дне чашки чернилами или тушью.
Для определения КМАФАнМ следует выбирать разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний.
На чашке может вырасти небольшое количество колоний, примерно 100, тогда подсчитывают все колонии. Если колонии распределены равномерно и их количество измеряется несколькими сотнями (200-300 колоний), допускается подсчет колоний не менее чем на 1/3 площади чашки. В этих случаях дно чашки делят карандашом на 6 секторов и считают колонии в 3 секторах. Затем делают пересчет на всю площадь чашки, т.е.
вычисляют среднее количество колоний на площади одного сектора и полученное количество колоний на одном секторе умножают на 6.По результатам подсчета общего количества бактерий число колоний, выросших на каждой чашке, умножают на соответствующее разведение и определяют среднее арифметическое по каждому разведению в отдельности. Полученные результаты по отдельным разведениям складывают между собой и выводят среднее арифметическое, которое принимают за окончательный результат.
Чтобы выразить общую бактериальную обсемененность обследуемого объекта на 1см2, полученный результат умножают на 0,1 (так как 1 мл смыва соответствует 1/10 всей массы бактерий, находившихся на 100 см2).
3.1.3 Результаты вычисления количества микроорганизмов в 1 см2 поверхности смыва выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) от 1,0 до 9,9 умноженным на 10n.
Результаты исследований записывают следующим образом: КМАФАнМ от 1,0х10n до 9,9 х10n КОЕ/см2.
3.2 Определение коли-титра БГКП.
Коли-титр - наименьший объём исследуемого материала, выраженный в миллилитрах, в котором обнаружено присутствие бактерий группы кишечной палочки.
3.2.1 Для определения коли-титра используют среду КОДА или Кесслера. Для этого пробирку с 5 мл среды вносят 1 мл исследуемого смыва (исходное разведение), во вторую пробирку - 1 мл его разведения 1:10. Посевы культивируют в термостате при температуре 37+1°С в течение 24-48 ч.
3.2.2 Посевы через сутки предварительно просматривают и для дальнейшего исследования отбирают пробирки с изменениями цвета среды КОДА до желтого или желто-зеленого, что свидетельствует о наличии бактерий группы кишечной палочки.
Если для исследования применялась среда Кесслера, тогда изменение цвета и помутнения среды, с наличием пузырьков газа в поплавках указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.
Окончательный учёт результатов проводят через 48 часов.
3.2.3 Учитывают пробирки, в которых обнаружены видимые изменения, указывающие на рост БГКП. При отсутствии видимых изменений в двух пробирках, коли-титр более 1. Если изменения произошли только в одной пробирке, засеянной исходным разведением, коли-титр равен 1. При наличии изменениях в двух пробирках коли-титр меньше 1.
3.3 Определении БГКП. Бактерии группы кишечной палочки включает в себя все аэробные и факультативно анаэробные грамотрицательные неспорообразующие палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа, к ним относятся - E.coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella и Seratia.
3.3.1 Для определения БГКП используют среду КОДА или Кесслера, для чего пробирку с 5 мл среды вносят 1 мл исследуемого смыва (исходное разведение). Допускается проводить смыв непосредственно в пробирку со средой КОДА или Кесслера, для чего монтируют пробирки как указано в п. 2.5., только вместо физиологического раствора используют 5 мл среды КОДА или 10 мл среды Кесслера. Посевы, культивируют в термостате при температуре 37+1°С в течение 24-48 часов.
3.3.2 Учёт изменений в пробирках проводят согласно п. 3.2.2.
3.3.3 Подтверждение принадлежности выросших на среде КОДА или Кесслера микроорганизмов к БГКП осуществляют по культурально-морфологическим особенностям. С этой целью из жидкой питательной среды проводят пересев на поверхность среды Эндо таким образом, чтобы получить изолированный рост. БГКП через 24 часа инкубирования при 37+1°С образуют красные, розовые колонии с металлическим блеском или без него. Из колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Бактерии этой группы – грамотрицательные, неспорообразующие палочки.
3.3.4 При росте БГКП дают заключение о наличии БГКП на 100 см2 поверхности или о наличии БГКП на всей поверхности (если смыв осуществлялся с мелкого инвентаря или оборудования).
4 Определение протея
К роду Proteus относятся грамотрицательные бескапсульные, в основном, подвижные бактерии, разжижающие желатину, расщепляющие мочевину и дающие положительную реакцию с метиловым красным.
4.1 .Посев проводят из исходного разведения по 0,5 мл в конденсат свежескошенного МПА по методу Шукевича. На второй день просматривают посевы на скошенном агаре, если наблюдается ползучий, нежный вуалеобразный рост, то с верхнего края выросшей культуры готовят препарат, окрашивают по Граму и микроскопируют. Наличие грамотрицательных полиморфных палочек указывает на наличии бактерий рода Proteus.
4.2 При росте таких бактерий дают заключение о наличии бактерий рода Proteus на 100 см2 поверхности или о наличии бактерий рода Proteus на всей поверхности (если смыв осуществлялся с мелкого инвентаря или оборудования).
5 Определение сальмонелл
Проводят посев тампона и смывной жидкости (оставшегося количества исходного разведения) на среды накопления (одну по выбору) селенитовую, магниевую, которые разливают в колбы по 50 мл. Посевы инкубируют 18-20 часов, при температуре 37+1°С, после чего проводят пересев на дифференциально-диагностические среды: висмут-сульфит агар, Эндо, Плоскирева или Левина (на одну по выбору). Посевы инкубируют при температуре 37+1°С 18-20 часов, после чего просматривают и отмечают колонии похожие на сальмонеллёзные. При этом имеют в виду, что сальмонеллы на висмут-сульфитном агаре растут в виде черных колоний с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией, исключение составляют S. choleraesuis, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum и некоторые другие, которые на висмут-сульфитном агаре образуют светло-зелёные колонии. На средах Эндо и Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных колоний, на среде Левина-голубоватых.
5.1 Микроорганизмы, имеющие культурально-морфологические свойства характерные для сальмонелл, подвергают дальнейшему исследованию, согласно, действующих методических указаний по лабораторной диагностике сальмонеллёза.
5.2 При выделении бактерий рода сальмонелл дают заключение о наличие патогенные в том числе сальмонелл на 100 см2 поверхности или о наличие патогенные в том числе сальмонелл на всей поверхности (если смыв осуществлялся с мелкого инвентаря или оборудования).
6 Учет результатов
6.1 При обнаружении санитарно-показательных микроорганизмов, а также КМАФАнМ выше установленных норм санитарное состояние объекта оценивается как неудовлетворительное, о чём незамедлительно сообщается руководителю предприятия (организации).
6.2 На объектах, санитарное состояние которых признано неудовлетворительным проводят мойку или дезинфекцию, после чего исследования повторяют.