Методические указания по ветеринарно-санитарному контролю качества замороженной спермы быков-производителей

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/123)

Методические указания подготовили: А.Э. Высоцкий, А.П. Лысенко, З.Н. Барановская, И.И. Румачик, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, С.А.

1 ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1 Настоящие методические указания устанавливают требования и порядок проведения ветеринарно-санитарного контроля замороженной спермы быков-производителей в ветеринарных диагностических лабораториях.

1.2 Настоящие Методические указания предназначены для лабораторных работников в ветеринарных диагностических лабораториях.

1.3 Организация по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных содержит племенных быков-производителей, которые используются для получения спермы. Указанная организация проводит работы по получению, обработке, контролю качества, хранению и поставке семени (спермы) для проведения искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, и создается по согласованию с Минсельхозпрода Республики Беларусь.

1.4 Семя (сперма) племенных животных может быть реализована другим лицам исключительно организациями по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных (племпредприятиями).

1.5 Методические указания разработаны на основании требований Международного ветеринарного кодекса, Международного эпизоотического бюро, уставных требований организаций по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных в целях ветеринарно-санитарного контроля качества замороженной спермы быков-производителей.

1.6 Методические указания содержат: описание порядка отбора проб спермы быков-производителей, методы микробиологических исследований на наличие условно-патогенных микроорганизмов и грибов. Приведены рецепты питательных сред, рекомендованные для микробиологического исследования замороженной спермы быка-производителя.

1.7 Быки, от которых отбирают сперму, должны быть клинически здоровы, и иметь отрицательные результаты лабораторных исследований, проведенные согласно действующим техническим нормативным правовым актам (ТНПА), на следующие инфекционные болезни: бруцеллез, туберкулез, паратубёркулезный энтерит, лептрспироз, инфекционный ринотрахеит, хламидиоз, лейкоз, трихомоноз, кампилобактериоз, вирусная диарея.

1.8 Технологию получения и криоконсервации спермы должны проводить в соответствии с действующими ТНПА.

1.9 Санитарный контроль качества спермы проводят по следующим показателям:

- определение общего количества микроорганизмов - микробное число в 1 дозе спермы;

- определение коли-титра в 1 см² спермы;

- наличие грибов.

2 ПОРЯДОК ОТБОРА ПРОБ СПЕРМЫ БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПО САНИТАРНОМУ КАЧЕСТВУ

2.1 Оценку санитарного качества каждой серии замороженной спермы быков-производителей проводит врач-микробиолог ветеринарных диагностических лабораторий. При закладке в карантинное хранилище, из каждой серии спермы для исследования отбирают 4-8 доз, в зависимости от расфасовки.

2.2 Взятие проб замороженной спермы для ветеринарно-санитарной оценки ее качества необходимо проводить с соблюдением правил асептики, с целью исключения контаминации спермы микрофлорой и окружающей среды.

2.3 Замороженная сперма быков должна быть отобрана для исследования посерийно.

2.4 Серией замороженной спермы считают любое количество доз, полученных от одного производителя из одного или нескольких смешанных эякулятов, заготовленных за один технологический цикл, оформленных одной датой, одним номером и документом о качестве.

2.4 Пробы отбирают стерильными пинцетами в сухие стерильные пробирки или флаконы и герметически закрывают стерильными пробками.

2.5 Пробу замороженной спермы, предназначенную для исследования, маркируют с указанием номеров серии, клички, инвентарного номера быка и даты замораживания спермы.

2.6 В замороженной сперме не допускается наличие патогенных микроорганизмов, грибов, микоплазм. Содержание непатогенных микроорганизмов (не вызывающих гемолиза, плазмокоагуляцию, гибель мышей и не проявляющих рост в присутствии санирующих веществ в терапевтических дозах) допускается до 500 м.т. в дозе. Коли-титр должен быть выше 0,1 см. т.е. отрицательный.

2.7 При наличии в хранилище замороженной спермы от быков-производителей не проверенных на инфекционные болезни в соответствии с действующими ТНПА, сперма бракуется и подлежит утилизации путем автоклавирования при 2 атм.

2.8 Из карантинного хранилища формируют среднюю пробу заморожен ной спермы полученной от одного быка в течение месяца. От каждой-серии отбирают 1-2-дозы, в зависимости о расфасовки спермы. Отбор проб спермы проводят в присутствии представителя ветеринарной лаборатории осуществляющей исследование не реже 1 раза в месяц. При получении неудовлетворительных результатов исследования проверяется каждая серия спермы.

2.9 Отобранные пробы спермы помещают в сосуды Дьюара, предварительно продезинфицированные, наполненные жидким азотом не менее 2/3 емкости и обеспечивающие ее хранение в замороженном состоянии на все время транспортировки и хранения до начала исследования.

2.10 К направляемым для исследования пробам спермы прилагается сопроводительный документ, в котором должно быть указано: наименование предприятия-изготовителя, его товарный знак, наименование продукции, данные о благополучии предприятия по инфекционным болезням и результаты последнего обследования быков-производителей, форма упаковки спермодоз, номера серий, дата замораживания спермы и количество спермодоз в серии, подпись руководителя предприятия и лица, проводившего отбор проб спермы.

2.11 Всю сперму, завезенную по импорту, выдерживают в карантинном хранилище не менее 30 дней. В этот период проводят исследования согласно настоящих методических указаний и действующих ТНПА.

2.12 На замороженную сперму реализуемую в пределах области, в которой находится организация по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных аккредитованной лабораторией выдается технологический паспорт (приложение 2). При вывозе спермы за пределы Республики Беларусь, кроме технологического паспорта, ветеринарным управлением области или республики выдается ветеринарное свидетельство о благополучии быков-производителей по инфекционным болезням (на основании результатов обследования) по утвержденной форме.

3 ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЯМ ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ

3.1 Флаконы или пробирки с замороженной спермой вынимают из жидкого азота и оставляют при комнатной температуре до полного оттаивания проб.

3.2 Пайетты, ампулы, облицованные гранулы со спермой перед вскрытием обрабатывают ватным тампоном, смоченным спиртом. Стерильным пинцетом придерживают один конец пайетты, ампулы или облицованной гранулы, а другой конец срезают стерильными ножницами. Размороженную сперму выливают в стерильную сухую пробирку.

3.2 Разведения для посевов спермы готовят следующим образом: к 0,9 см³ стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида добавляют 1 см³ оттаянной спермы. Тщательно перемешивают и готовят десятикратные разведения, в зависимости от степени ожидаемой контаминации спермы, начиная с разведения 1:10.

Для каждого разведения спермы используют одну стерильную пипетку. Раствор набирают с помощью резиновой груши или полиэтиленого баллончика и тщательно (не менее трех раз) промывают пипетку раствором из той пробирки, в которую внесли суспензию.

4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО (МИКРОБНОГО ЧИСЛА) МИКРООРГАНИЗМОВ В 1 МЛ СПЕРМЫ

4.1 Сперму, подготовленную, как указано в п. 3.2 высевают на одну из следующих трех питательных сред: 2%-ный мясо-пептонный агар с 1% глюкозы и 5% крови барана или крупного рогатого скота, агар Хоттингера или тиогликолиевую среду (приложении 1).

4.2 Разбавленную сперму переносят из среды (высевают) стерильной градуированной пипеткой в количестве 1,0 см³ в чашки Петри (из расчета не менее трех чашек на каждое разведение) и равномерно распределяют материал по всей поверхности агара покачиванием чашек. Чашки с посевами помещают в термостат при температуре 37^оС и инкубируют в течение 48 часов. Подсчет колоний, выросших на поверхности агара и определение числа микробных тел в 1 дозе (микробное число) проводят согласно ГОСТ 20909.2-75.

5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИ-ТИТРА

5.1 Разбавленную согласно п. 3.2 сперму в количестве 1 см³ вносят в пробирку со средой Булира. Посевы выдерживают в термостате при температуре 44-45^оС в течение 24 часов. В результате осмотра пробирок устанавливают бродильный титр.

5.2 К группе кишечной палочки относят вес разновидности кишечной палочки, способные ферментировать жидкую среду, содержащую глюкозу и маннит с выделением кислоты и газа в течение 24 часов инкубации при температуре 44-45^оС.

5.3 При отсутствии помутнения среды газообразования реакцию считают отрицательной. Изменение цвета среды (пожелтение, помутнение) и газообразование (пузырек в газовке), указывает на наличие в среде микробов из группы кишечной палочки. В этом случае реакцию считают положительной.

5.4 При наличии положительной реакции на бродильный титр проводят исследование на идентификацию кишечной палочки согласно ГОСТ 20909.2-75.

5.5 Коли-титром считают наименьший объем исследуемого материала, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Коли-титр выражают степенью разведения: 1:10 – 0,1; 1:100 - 0.01 и т.д.

6 ИССЛЕДОВАНИЕ НА НАЛИЧИЕ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, АНАЭРОБНОЙ МИКРОФЛОРЫ, ГРИБОВ

6.1 Для выделения синегнойной палочки исследуемый материал высевают на мясопептонный бульон с добавлением 1-2% сахара (глюкозы, лактозы) и инкубируют посевы в течение 6-7 суток в термостате при температуре 37 ± 0.5^оС, проверяя рост каждые 1-2 дня. При росте микроб продуцирует водорастворимый пигмент пноцианин, который постепенно окрашивает бульон в зеленовато-голубой цвет. На мясопептонном агаре он дает круглые голубовато-серые колонии. При микроскопии грамотрицательная палочка. Основной признак культуры синегнойной палочки – положительная хлороформная проба: к 18-и часовой культуре добавляют 1,0 мл хлороформа. Культура, давшая положительную реакцию (окраска хлороформа в синий цвет), относится к синегнойной палочке.

6.2 Для выделения анаэробных бактерий, помимо соответствующей среды и температурного оптимума, требуется создание безкислородных условий. Лучше всего для выращивания анаэробов применять среду Китт-Тароцци. Исследуемый материал засевают по 1-2 капли в 2 пробирки с указанной средой. Одну из пробирок, после посева материала, подогревают в водяной бане при температуре 80^оС в течение 20 минут для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры.

6.3 Для исследования на наличие грибов, чашки с высевами спермы на мясопептонном агаре после подсчета количества микробных тел оставляют при комнатной температуре на 8-10 суток в месте, удаленном от прямых солнечных лучей. По истечение этого срока, чашки с посевами проверяют на наличие в них роста грибов. Идентифицирование выросших грибов проводят согласно действующим ТНПА.

7 ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРООРГРНИЗМОВ

7.1 Чашки с первичными посевами, после учета числа выросших в них микроорганизмов, используют для выделения чистых культур (изолятов.) с последующей их идентификацией.

7.2 Изучают визуально морфологию колоний микроорганизмов, выросших на чашках с питательными средами: размер, форму, поверхность, цвет.

7.3 Из колоний, выросших на питательной среде, готовят мазки, окрашивают их по Грамму, микроскопируют и делят микроорганизмы в зависимости от окраски на грамположительные и грамотрицательные.

7.4 Для выделения чистой культуры изолированную колонию одного вида или ее часть бактериологической петлей над пламенем горелки переносят в пробирки с мясопептонным бульоном (МПБ) и на поверхность скошенного мясопептонного агара (МПА) штрихом. Посевы инкубируют при температуре 37,5 ± 0,5^оС 24-48 часов.

7.5 Выделение чистой культуры необходимо для изучения культуральных и ферментативных признаков, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроба.

7.6 Изучение морфологических и культуральных свойств микробов в посевах на МПА отмечают наличие пигмента и другие морфологические особенности. В посевах на МПБ отмечают рост бактерий с равномерным помутнением среды, придонный рост с образованием осадка на дне (скудным или обильным, крошковидным или хлопьевидным), образование пигмента, наличие на поверхности бульона пленки или пристеночного кольца.

7.7 При изучении ферментативных свойств определяют наличие протеолитических ферментов, сахаролитических и других свойств. Для этого исследуемую культуру высевают на специальные дифференциально-диагностические среды.

8 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

8.1 Патогенность микробов определяют по гемолитическим, плазмокоагулирующим свойствам и биопробе - способности убивать белых мышей.

8.2 Гемолитические свойства - способность гемолизировать эритроциты крови – определяют на чашках Петри с кровяным агаром. Для этого изолированную культуру микроба высевают на поверхность МПА, содержащего 5% крови. Посевы инкубируют при температуре 37 ± 0,5^оС в течение 48 часов. При наличие вокруг выросших колоний зон гемолиза альфа или бета-реакцию считают положительной.

8.3 Плазмокоагуляция - способность патогенных микробов (преимущественно стафилококков) свертывать цитратную плазму крови кролика. Реакцию плазмокоагуляции проводят с использованием сухой стандартной плазмы кролика, в соответствии с действующими ТНПА.

Для постановки реакции берут 0,5 см³ плазмы, разведенной 1:5, которую переносят в стерильную пробирку и добавляют 18-20 часовую культуру изолята (культуру берут бактериологической петлей). Пробирки помешают в термостат при 37,5 ± 0,5^оС и проверяют наличие свертывания плазмы через 1, 2, 5, 18 и 24 часа.

Патогенные микробы продуцируют фермент плазмокоагулазу, который свертывает плазму. Реакция считается положительной независимо от времени свертывания плазмы и вязкости сгустка.

Приложение 1

Рецепты питательных сред, рекомендованные для микробиологического исследования замороженной спермы

2%-ный МПА с 1% глюкозы и 5% крови барана: мясопептонный бульон – 1,0 мл; агар – 20,0 мл; глюкоза – 10,0 г; цитрированная кровь барана – 50,0 мл (рН среды 7,0-7,2).

Тиогликолевая среда: дистиллированная вода – 1,0 л; панкреатический гидролизат казеина – 15,0 г; экстракт дрожжей – 5,0 г; натрия хлорид – 2,5 г; глюкоза – 5,0 г; тиогликолиевая кислота (тиогликолят натрия) – 0,3 мл (рН среды 7,6-7,8).

Среда Хоттингера: водопроводная вода – 800,0 мл; перевар Хоттингера – 200,0 мл; натрия хлорид – 0,4 г; агар – 2,5 г (рН среды 7,6-7,8).

Среда Булира: мясопептонный бульон – 100, 0 мл; манит – 250,0 мг; глюкоза – 10,0 г; насыщенный водный раствор нейтральрота – до окрашивания смеси в вишнево-красный цвет (рН среды 7,0-7,4).

Среда Китт-Тароцци: печень крупного рогатого скота или мясо нарезают мелкими кусочками, заливают троекратным количеством питательного бульона (рН среды 7,4-7,6) и кипятят 30 минут. Мясопептонный бульон фильтруют, а печень (мясо) промывают на сите водопроводной водой. Распределяют по пробиркам по 3-4 г печени или мяса и по 7-8 мл бульона. Стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут.

Приложение 2

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ НА СПЕРМУ БЫКА

1. Название и адрес организации-владельца быка-производителя______________________________________________________

2. Сведения о быке-производителе:

Кличка_______________________________________________________

Инд. №_______________________________________________________

Порода ______________________________________________________

Данные о сперме:

Количество доз замороженной спермы____________________________

Дата отправки_________________________________________________

Способ замораживания (гранулы, пайетты)________________________

Концентрация (млн в дозе) (не менее 15 млн)_______________________

Подвижность сперматозоидов, % (не менее 4,0)_____________________

Объем дозы см³________________________________________________

Выживаемость спермы при 38^оС часов____________________________

Общее количество непатогенных

микробных тел в дозе (не более 500 м.т)___________________________

Коли-титр____________________________________________________

Сперма соответствует ГОСТ 26030-83_____________________________

Температура хранения,

отправляемой замороженной спермы_____________________________

Технологический паспорт

на сперму выдан_______________________________________________

(число, месяц, год)

врач-микробиолог ветеринарной

диагностической лаборатории ___________________________________

Главный технолог организации__________________________________

М.П.