Методические рекомендации по хранению культур микроорганизмов в диагностических ветеринарных лабораториях

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/128)

Методические рекомендации подготовили: А.Э. Высоцкий, А.П. Лысенко, З.Н. Барановская, И.И. Румачик, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, Г.Е.

Общие положения

Настоящие Методические рекомендации определяют порядок хранения бактерий в диагностических ветеринарных лабораториях, научно-исследовательских организаций и высших учебных заведений ветеринарного профиля.

В диагностических и учебных микробиологических лабораториях постоянно существует проблема сохранения выделенных и эталонных культур бактерий.

Метод лиофильного высушивания бактерий

Метод лиофильного высушивания является оптимальным для решения этой задачи, но он не всегда применим в повседневной работе. Сохранение культур бактерий преследует двоякую цель. Во-первых, поддержание микроорганизмов в жизнеспособном состоянии, во-вторых – обеспечение условий, снижающих их изменчивость.

Самым доступным и наиболее используемым методом хранения является периодический пересев культуры на питательные среды. Длительность интервалов между пересевами в первую очередь определяется свойствами микроорганизмов, а также подбором оптимальной поддерживающей среды и температуры хранения. В зависимости от перечисленных факторов пересевы могут следовать с частотой от нескольких дней до месяцев (таблица).

Таблица

Время выживания бактерий при использовании различных методов их хранения

Примечание: Частота пересевов зависит от используемой среды.

В качестве поддерживающих целесообразнее использовать минимальные среды, на которых метаболизм микроорганизмов значительно снижен. Во-вторых, должны быть созданы условия для предотвращения высыхания питательных сред, что достигается заливкой ватно-марлевых пробок в пробирках расплавленным парафином, закрытием их резиновыми колпачками, помещением пробирок с посевами в пластиковые мешки, использованием резиновых пробок и завинчивающихся колпачков с резиновыми прокладками, заливка сред с культурами вазелиновым маслом. Скорость метаболизма микроорганизмов существенно снижается, если храпение осуществляют при 4-6°С.

Жидкие питательные среды не считаются оптимальными из-за повышенной вероятности контаминации культур. Аэробные бактерии поддерживают чаще всего посевом на скошенные агаровые среды, анаэробы — в толщу плотной среды или в жидкую среду, микроаэрофилы и факультативные анаэробы — в полужидкий агар (0,2-0,3%).

Для энтеробактерий одной из оптимальных для этих целей является среда Дорсета, стрептококков—мясная питательная среда Робертсона. Для более длительного хранения выращенных культур используют следующие методы.

Хранение культур микроорганизмов под минеральным маслом

Масло предотвращает высыхание среды, замедляет метаболизм. Стерильным вазелиновым маслом заливают коротко скошенный (угол 40 градусов) плотный, полужидкий агар, бульонные культуры. Используют стерильное высокоочищенное медицинское вазелиновое масло с удельной плотностью 0,865-0,890. Вазелиновое масло рекомендуется стерилизовать не автоклавированием, а в сушильном шкафу при 170°С в течение 1-2 часов. Культуры заливают маслом с таким расчетом, чтобы его слой приблизительно на 1 см превышал поверхность или край питательной среды.

Культуры хранят в вертикальном Положении в холодильнике при температуре 4-6° С. В случае необходимости культуру можно извлекать бактериологической петлей, при пересеве предварительно удаляют вазелиновое масло.

Хранение микроорганизмов в дистиллированной воде или 1% -ном растворе натрия хлорида

Используют культуры, выращенные на оптимальных питательных средах в стадии начала стационарной фазы роста.

Использование замораживания для хранения культур микроорганизмов

Хранение микрооорганизмов в замороженном состоянии достаточно универсальный метод. При температурах 20-40° С хорошо сохраняют жизнеспособность немногие виды бактерий. Хранение при более низких температурах достаточно эффективно, но требует специального оборудования.

Жизнеспособность бактерии лучше сохраняют при использовании кри-опротекторов, например глицерина. Суспензии спор бактерий хорошо сохраняются при 20^оС в растворе глицерина, в остальных случаях длительность сохранения жизнеспособности нужно определять опытным путем. Суспензию бактериальных клеток (середина экспоненциального роста) смешивают 1:1 с 50%-ным стерильным глицерином, разливают по пробиркам и хранят при -20° С.

Более эффективно хранение культур при сверхнизких температурах, но оно требует специального оборудования.

Некоторые лабильные виды бактерий удается сохранять жизнеспособными годами (до 15 лет и более). Обычно бактерии суспензируют в криоп-ротекторах, чаще всего в глицерине и диметилсульфоксиде (ДМС), возможно использование сахарозы, глюкозы, декстрана, поливинилпироллидона. Глицерин стерилизуют в автоклаве, ДМС – фильтрованием и хранят в замороженном состоянии не более 1 месяца при 5°С. Из культуры готовят взвесь бактерий концентрацией 10¹⁰-10¹¹ мк/мл в среде, содержащей 10% глицерина (объем) или 5% ДМС (объем/объем), разливают по толстостенным ампулам или стерильным полипропиленовым пробиркам, ампулы запаивают. Ампулы и пробирки в коробках из стали помещают в морозильник с температурой -60° С на 1 час, а затем в жидкий азот. В случае потребности ампулы (пробирки) извлекают и быстро оттаивают, помещая в водяную баню с температурой 37^оС.

Упрощенный вариант высушивания культур бактерий

Культуру выращивают 18-24 часа на скошенном МПА, затем в пробирку вносят 2 мл суспензионной среды (суспензионная среда: бульон - 100 мл, желатина - 10 г, рН 7,5, автоклавируют15 минут при 115° С), расплавленной при 37°С, смывают бактериальную массу и по каплям переносят при помощи пастеровской пипетки на диски парафинированной фильтровальной бумаги (парафинированная фильтровальная бумага: в чашку Петри наливают расплавленный стерильный парафин и помещают в него диски из фильтровальной бумаги), лежащие в стерильной чашки Петри. Затем открытую чашку Петри переносят в эксикатор, содержащий Р₂О₅, снижают в нем давление до 100-300 мм ртутного столба и ведут сушку при комнатной температуре 2-3 суток. Образовавшийся желатиновый диск переносят в стерильную пробирку, закрывающуюся ватной пробкой и хранят при пониженном давлении в сосуде с Р₂О₅.

Можно желатиновые диски помещать в стерильные пробирки с силика-гелем и резиновой или завинчивающейся пробкой.

Лиофилизация (высушивание из замороженного состояния)

При лиофилизации воду из замороженной суспензии бактерий удаляют при низком давлении, минуя жидкую фазу (сублимация). Существует большое количество приборов для данной цели.

Подготовка культуры. Чаще бактерии выращивают на плотных питательных средах до начала стационарной фазы роста и для сушки используют взвеси концентрацией 10¹⁰-10¹¹ микробных клеток в 1 мл. В случае жидких культур клетки необходимо осаждать центрифугированием и затем осадок ресуспензировать в криопротекторе.

Криопротекторы. Достаточно часто используют сахарозо-желатино-вую среду: сахароза — 10,0 г, желатина — 1,0 г, дистиллированная вода — 1000 мл, рН 7,0-7,2, стерилизуют при 110°С два дня подряд по 30 минут. Также применяют 10%-ный раствор декстрола; нормальную сыворотку крови; обезжиренное молоко и т.д.

Подготовленную взвесь разливают пастеровскими пипетками, шприцами с длинными иглами в ампулы емкостью 1 мл по 0,1-0,3 мл, которые должны быть толстостенными, стерильными, закрытыми рыхлыми ватными пробками.

Высушивание проводят в вакууме при 3-10 мм ртутного столба в течении 18-20 часов, затем подогревают до 30^оС и сушат еще 18-20 часов. После окончания высушивания ампулы запаивают под вакуумом ниже ватной пробки, затем выборочно проверяют в них наличие вакуума при помощи аппарата д'Арсонваля в затемненной комнате. Ампулы с вакуумом светятся светло-фиолетовым или зеленоватым светом. Участки ампул, подвергнутые пайке, парафинируют или покрывают нитролаком. Лиофилизированные культуры лучше хранить при 5-10^оС.

Реактивация лиофилизированных культур бактерий

Поверхность ампулы дезинфицируют, около верхнего конца делают надрез пилкой или запаянный конец нагревают и касаются его поверхности влажной ватой. После вскрытия в ампулу вносят 0,3-0,4 мл оптимальной жидкой питательной среды, растворенное содержимое засевают в пробирки с жидкой, полужидкой или плотной питательными средами и инкубируют. Как правило, лаг-фаза при посеве лиофилизированных культур более длительная, поэтому заключение о жизнеспособности бактерий нельзя делать после краткого культивирования.