Методические рекомендации по проведению стерилизации предметов и жидкостей в ветеринарных диагностических лабораториях

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/136)

Методические рекомендации подготовили: А.Э. Высоцкий, А.П. Лысенко, З.Н. Барановская, И.И. Румачик, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, С.А.

Общие положения

Настоящие Методические рекомендации определяют порядок проведения стерилизации предметов и жидкостей для диагностических ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских организаций и высших учебных заведений ветеринарного профиля, используемых при диагностике болезней животных (включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел).

МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

1 Автоклавирование

Эффект стерилизации при автоклавировании основан на нагревании объекта перегретым насыщенным паром, который, конденсируясь на холодных объектах, выделяет тепло. Использование насыщенного пара позволяет избегать обезвоживания тканей, бумаги, резины, которые по этой причине разрушаются при воздействии сухого жара.

Эффективное автоклавирование достигается при удалении воздуха из автоклава. Воздух обычно вытесняется паром. Поэтому все предметы должны быть размещены таким образом, чтобы не мешали вытеснению воздуха, то есть не слишком плотно. Если емкость (банку, склянку) поместить дном вверх, то воздух из нее вытеснен не будет. По этой же причине стерилизуемые предметы не следует заворачивать в фольгу, которая плохо пропускает воздух и обычная бумага, если она влажная. Существуют конструкции автоклавов, в которых предусмотрено удаление воздуха вакуумным насосом.

После загрузки в автоклав стерилизуемых предметов через воронку наливают воду до черты, имеющейся на водомерной трубке. Автоклав закрывают крышкой, открывают выводной кран, включают нагревание до выхождения непрерывной струи «сухого» пара из выводного крана, истечение чистого пара продолжают 10 минут. Затем выводной кран закрывают, и давление пара в камере автоклава начинает возрастать до уровня выбранного режима стерилизации.

Отсчет времени стерилизации начинают с момента достижении необходимого давления. В автоклавах с электрическим нагревом подача пара в процессе стерилизации регулируется автоматически при помощи электроконтактного манометра. На манометре автоклава указано давление выше атмосферного. Зависимость температуры от давления приведена в таблице 1.

Таблица 1

Температура насыщенного пара при различных давлениях выше атмосферного

Истинную температуру в автоклаве можно проверить помещая в камеру вещества, плавящиеся при различной температуре. На 100 г того или иного вещества берут 0,01 г краски (метиленовый синий фуксин) и смесь насыпают в пробирку. Обычно используют следующие вещества: аскорбиновая кислота — температура плавления 187-192°С; тиомочевина —180°С; глюкоза — 146°С; мочевина — 132°С; бензойная кислота – 121-122°С; сера — 119°С; бензаурин —115°С; фенантрен — 98-100^оС. При достижении соответствующей температуры вещество расплавляется и равномерно окрашивается в цвет красителя.

Автоклавирование обычно проводят при 121°С (1 атм.) 15-45 минут, при 128°С (1,5 атм.) 10 минут. При необходимости, в зависимости от характера объекта, режим стерилизации меняют. Общеупотребительные мясопептонные среды стерилизуют при 1 атм. 20 минут, учитывая, что агаровые среды требуют время стерилизации в два раза больше, чем жидкие.

В ходе автоклавирования из сред, растворов теряется до 5% воды, поэтому, если необходимо точно соблюдать концентрацию раствора, следует учитывать данное явление. При кислых значениях стерилизуемой среды раствора необходимо принимать во внимание возможный гидролиз субстрата, что приводит к текучести желатина, агара. При щелочных значениях среды происходит карамелизация углеводов (недопустимо!), выпадение в осадок солей железа.

Среды с углеводами при исходном значении рН более 7,0 могут закислиться до рН 6,0. Поэтому рекомендуется углеводы, фосфаты, соли железа автоклавировать отдельно при оптимальных значениях рН и только потом вносить в необходимых пропорциях в среды, растворы.

При стерилизации материалов в сосудах разных объемов следует учитывать, что скорость достижения стерилизующей температуры зависит от объема (таблица 2) и ориентироваться надо на сосуд большего объема. Лучше стерилизовать среды, растворы близкого объема, т.к. в случае термолабильных компонентов стерилизация содержимого большего объема будет достигнута при денатурации того же субстрата в малых объемах. Если среды стерилизуют при 0,5 атм., то посуда, в которую их разливают, должна быть стерильной. При давлении 1 атм. и более предварительную стерилизацию посуды можно не проводить.

Таблица 2

Зависимость продолжительности стерилизации жидкостей от объема сосудов

2 Стерилизация сухим жаром

Стерилизацию сухим жаром (нагретым воздухом) проводят в печах Пастера.

Таблица 3

Способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов

Минимальное время, необходимое для стерилизации сухим жаром, составляет при 140°С — 180 мин., 150°С — 150 мин., 160°С — 120 мин., при 170°С — 60 мин. Температура воздуха по возможности не должна превышать 160°С, т.к. определенные сорта бумаги и ваты при более высокой температуре выделяют вещества, ингибирующие рост некоторых бактерий. После окончания стерилизации печь не следует открывать до ее охлаждения.

3 Дробная стерилизация текучим паром (тиндализация)

Используют для стерилизации питательных сред, компоненты которых денатурируются при температуре свыше 100°С (молоко, углеводы и т.д.). Материал стерилизуют в текучепаровом аппарате или автоклаве при открытом выпускном кране. В камере стерилизуемые объекты размещают неплотно, чтобы пар проходил свободно.

Режим стерилизации: прогревание паром по 30 минут ежедневно в течение трех суток.

В некоторых случаях, например для стерилизации сред, содержащих белок, прогревание материала проводят в водяной при 60-65°С по часу в течение пяти суток или при 70-80°С в течение трех дней.

4 Стерилизация фильтрованием

Фильтрованием стерилизуют растворы термолабильных веществ: витамины, аминокислоты, белки, антибиотики, дрожжевой экстракт и т.д. Стерилизацию проводят при помощи фильтров следующих типов:

Фильтры Зейтца. Пластина из смеси асбеста с целлюлозой, со следующими характеристиками: ЕК — поры диаметром 1,5-1,8; ЕКS — 1,2-1,5; ЕКS-1 — 1,0-1,2; EКП — 0,9-1 мкм, отечественные Ф2 — фильтрующие, СФ-3 и СФ-4 стерилизующие. Фильтр кладут на сетку, вставляют в держатель, при этом обращают внимание на то, что верхняя поверхность фильтра флоккулирована. Слабо закручивают барашки и не очень плотно вставляют держатель в приемник. Смонтированную систему обертывают бумагой и стерилизуют 30 минут при 110°С. Перед работой заливают расплавленным парафином снаружи пробку по периметру ее контакта с приемником, фильтр смачивают физиологическим раствором, равномерно закручивают барашки держателя и фильтруют при небольшом отрицательном или положительном давлении, по возможности постоянном. Следует иметь в виду, что фильтрование незабуференного раствора может привести к изменению рН за счет содержания щелочных соединений в пластине, поэтому в таких случаях первую порцию фильтрата надо удалить.

Мембранные фильтры. Пористые диски из нитроцеллюлозы. Для стерилизации применяют отечественные фильтры № 1-4 с диаметром пор соответственно 0,3-0,5-0,7-0,9 мкм, фирмы «СИНПОР» № 5-10, фирмы «Миллипор» марок V7, VМ, VС, SIGS, SIНА, DА. Стерилизующие мембраны помещают в воду и автоклавируют 15 минут при 121°С, затем стерильную мембрану переносят в держатель, предварительно стерилизованный. Допускается стерилизация фильтра непосредственно в держателе в автоклаве (возможно повреждение пор) или кипячением в дистиллированной воде в течение 30-60 минут. При использовании фильтра Зейтца поступают следующим образом: на проволочную сетку помещают вырезанное по диаметру резиновое кольцо из тонкой резиновой перчатки и диск фильтровальной бумаги, затем кладут собственно фильтр, сверху снова диск фильтровальной бумаги и резиновое кольцо.

Пористые стеклянные фильтры. Используют мелкопористые фильтры с диаметром пор