Определение ферментативной активности слизистой оболочки тонкой кишки методом ступенчатой десорбции ферментов

Закономерности процессов полостного и мембранного пищеварения в тонкой кишке позволяет изучить методика, разработанная Э.А. Забелинским [119]. Суть метода заключается в поэтапном извлечении ферментов, расположенных в структурах гликокаликса, щеточной кайме и энтероцитах, которые составляют пять проб (С, Ді, Д2, Дз, Г).

Первая проба характеризует активность панкреатической а-амилазы, расположенной в структурах гликокаликса. Последующие три пробы отражают ферментативную активность и прочность связей десорбируемых фракций у- амилазы с клеточной мембраной энтероцитов щеточной каймы тонкой кишки. Пятая проба свидетельствует об активности внутриклеточной фракции фермента, а значит, о ферментообразующей функции энтероцитов.

Фракции амилазы слизистой оболочки тонкой кишки получали путем последовательной десорбции фермента в раствор. Для получения первой С- фракции а-амилазы биоптат слизистой оболочки тонкой кишки массой 25-30 мг помещали в 4 мл охлажденного раствора Рингера (0-1°С) и отмывали в течение 30 с, чтобы удалить содержимое кишечника из межвосинчатых пространств. Последовательную десорбцию амилазы с поверхности слизистой оболочки тонкой кишки проводили на встряхивателе АВУ-1. Фрагмент слизистой оболочки, помещенный в 4 мл охлажденного раствора Рингера (0-1°С), отмывали на встряхивателе в течение 3 мин. Затем его последовательно переносили во вторую и третью порции раствора Рингера, взятого также по 4 мл, и отмывали на встряхивателе по 3 мин. На данном этапе эксперимента получали три десорбируемые фракции у-амилазы: Ді-фракция легко десорбируемой у-амилазы, Д₂-фракция среднедесорбируемой у-амилазы и Д₃-фракция труднодесорбируемой у-амилазы. Суммарная активность десорбируемых фракций (ХД) характеризует процессы пристеночного пищеварения.

После завершения десорбции биоптат слизистой оболочки тонкой кишки подвергали гомогенизации. После взвешивания на торсионных весах его переносили в охлажденную ступку и растирали. Полученный гомогенат смывали 4 мл охлажденного раствора Рингера и помещали в центрифужную пробирку. Взвесь центрифугировали при 5000g в течение 10 мин. Надосадочная жидкость служила источником определения амилолитической активности гомогената (фракция Г).

В пяти полученных пробах амилолитическую активность определяли по методу B.W. Smith и I.M. Roe в модификации А.М. Уголева [118]. Принцип метода основан на калориметрическом определении убыли крахмала из ферментного раствора вследствие его гидролиза и ее оценке по изменению окраски йод-крахмального раствора. В качестве субстрата использовали голубой крахмал, приготовленный в нужной концентрации на растворе Рингера (рН 7,0).

Реактивы: 1. дистиллированная вода - 100 мл); 2. раствор Люголя (чистый кристаллический йод - 0,1; йодид калия (KJ) - 1,0; 3. 1 Н раствор НСІ; 4. 0,1% раствор голубого крахмала, приготовленный на растворе Рингера (200 мг голубого крахмала помещается в 200 мл раствора Рингера, суспензия кипятится в течение 1 мин, охлаждается до комнатной температуры. Раствор готовится ex tempore).

Ход определения: 0,5 мл раствора амилазы, полученные при промывании фрагмента слизистой оболочки тонкой кишки, инкубировали в ультратермостате при t 37°С с 0,5 мл 0,1% раствора крахмала в течение 30 мин. Объем инкубационной смеси доводили до 1 мл раствором Рингера. После инкубации в исследуемый материал добавляли 2 мл раствора, содержащего 0,5 мл 1 Н раствора HCI, 0,5 мл раствора Люголя и 8 мл дистиллированной воды, для инактивации фермента и индикации негидролизованного субстрата. Содержание негидролизованного крахмала определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 580 нм путем сравнения опытного и контрольного растворов и выражали в условных единицах. При приготовлении контрольного раствора вместо ферментной смеси добавляли раствор Рингера в тех же пропорциях.

Исследования выполнены в лаборатории кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии Омской государственной медицинской академии (зав. кафедрой - засл. деятель науки РФ, профессор В.Т. Долгих).

2.4