Выделение и очистка витамина В2

Культуральная жидкость после ферментации представляет собой сложную физико-химичес­кую систему, в состав которой входят:

• рибофлавин — 20 г/л, в том числе 18-19 г/л в виде кристаллов и 1-2 г/л в растворенном состоянии;

• клетки продуцента занимают объем около 5 % ;

• нерастворимые компоненты ферментационной среды (дрожжи и др.);

• неорганические соли из компонентов среды, а также из рН-статирующих растворов;

• органические неиспользованные компоненты среды;

• продукты метаболизма бактерий (ацетоин, диацетил и бутандиол и др.).

Общее количество сухих веществ составляет 10—15 % .

Для снижения концентрации рибофлавина, находящегося в растворенном состоянии, в кульч ральную жидкость при непрерывном перемешивании без доступа воздуха добавляют гидросульф, натрия (который является восстановителем) в соотношении 1:1 по отношению к рибофлавину. Пі этом выпадает осадок зеленого цвета, свойственный лейкофлавину. Суспензию затем отделяют сен рацией или центрифугированием при 10-15 °С . Фугат сливают в канализацию. Осадок в виде пасі далее подвергают автолизу, предварительно разбавив водой. Для этого вносят уксусную кисло и этилацетат (1,2-1,3 и 0,7-0,8 % соответственно по отношению к объему осадка до разведения).

Процесс проводят при свободном доступе кислорода при непрерывном перемешивании и темі ратуре 45-50 °С в течение 20-24 ч. При этом лейкорибофлавин окисляется до рибофлавина, ч . сопровождается переходом зеленой окраски в желтую. После окончания автолиза автолизат разв дят водой в 2-2,5 раза по объему до содержания сухих веществ 10-12 % водопроводной водой и с парируют или центрифугируют с целью отделения осадка, содержащего витамин. Осадок рибь лавина высушивают на распылительной сушилке, прёдварительно разбавив водой до содержат сухих веществ 13-15 % . Сушильным агентом служит воздух нагретый до температуры 190 ± 10°( Полученный продукт имеет влажность не более 8 % и содержание рибофлавина около 70% .

В случае необходимости получения кристаллического рибофлавина применяют следующий М‘ тод его выделения из культуральной жидкости. Вначале кристаллы рибофлавина переводят полностью растворенное состояние за счет нагревания и добавления концентрированной соляне кислоты. Горячий раствор подвергают фильтрации (микрофильтрации до отделения взвешеннь частиц клеток и др.). Фильтрат охлаждают и в случае необходимости добавляют восстановител Полученные технические кристаллы (90-95 % витамина) подвергают перекристаллизации из ра твора соляной кислоты, органических растворителей или воды. В результате получают препар; кристаллического рибофлавина с содержанием основного вещества не менее 98 %.

Дополнительная литература

1. Березовский В. М. Химия витаминов./М.: Пищ. пром-сть, — 1973.

2. Бреслер С. Е., Горинчук Г. Ф., Черник Т. П., Перумов Д. А. Оперон биосинтеза рибофлавин у Вас. subtilis. Исследование мутантов по начальным стадиям биосинтеза. Происхождение боково, рибитильной цепи./Генетика. — 1978. Т.14. 2082-2090 стр.

3. Куканова А. Я., Жданов В. Г., Степанов А. И. Мутанты Вас.subtilis, устойчивые к розеофлави ну. /Генетика. — 1982. Т.18. 319-321 стр.

4. Степанов А. И. Генетика и генная инженерия продуцента рибофлавина на основе бацилл /Биотехнология. — 1985. Т.2. 14-17 стр.

5. Гершанович В. Н., Куканова А. Я., Галушкина 3. М., Степанов А. И. Мутация по транскетолаз> у рибофлавинсинтезирующих штаммов Bacillus subtilis./Молекулярная генетика, микробиологи; и вирусология. — 2000. № 3. 3-7 стр.

6. Гершанович В. Н., Галушкина 3. М., Большакова Т. Н. и др. Ферменты ассимиляции азота у му таитов Bacillus subtilis с гиперпродукцией рибофлавина./Молекулярная генетика, микробиологи; и вирусология. — 2005. № 2.

7. Патент России № 2081175. Степанов А. И., Куканова А. Я., Галушкина 3. М. и др. Штамл Bacillus Subtilis — продуцент рибофлавина. — 1994.

Контрольные вопросы

1. Какие физические и химические свойства рибофлавина учитываются при определении его кон центрации и способах выделения?

2. Какие существуют способы получения рибофлавина?

3. Какие механизмы регуляции биосинтеза рибофлавина-были применены при получении реком бинантного штамма — продуцента витамина В₂?

4. Какие физиолого-биохимические свойства штамма были учтены при создании процесса биосин теза рибофлавина?

5. Охарактеризуйте основные этапы технологического процесса.

8.