Выделение (3-каротина, ликопина и других жирорастворимых компонентов биолипидного комплекса гриба BI. trispora
Разработанные способы выделения изопреноидных соединений из биомассы микроорганизмов, как правило, включают следующие стадии: экстракции, кристаллизации или осаждения, омыления биомассы или липидов раствором щелочи.
Существует несколько различных методов получения кристаллического p-каротина и ликопина из биомассы микроорганизмов. Первоначально способ получения этих каротиноидов из биомассы продуцента, предусматривал проведение следующих технологических операций:
• сушку биомассы этиловым спиртом;
• многоступенчатую экстракцию каротиноидов из неизмельченной биомассы с использованием неполярных органических растворителей — к-алканов, и их хлорпроизводных;
■ отгонку растворителя;
• охлаждение экстракта и кристаллизацию каротиноидов;
• разбавление полученной суспензии кристаллов растворителем (ацетоном, метанолом, этанолом), играющим роль высаливающего агента, отделение кристаллов и их промывку и сушку под вакуумом.
Известно что каротиноиды в силу своей уникальной химической структуры легко подвержены окислению и изомеризации при действии кислорода воздуха и света. Поэтому весь технологический процесс необходимо проводить в мягких условиях и под атмосферой инертного газа, например азота.
Недостатками указанного метода являются:
• экстракция каротиноидов из неизмельченной биомассы, и как следствие, относительно низкая степень извлечения каротиноидов из биомассы в экстракт;
Рис. 7. Технологическая схема процесса получения каротин- (ликопйн) содержащей биомассы.
I. Приготовление и подготовка компонентов среды культивирования. 2. Раздельное выращивание ( +■) и ( ) форм гриба на косяках, качалочных колбах, инокуляторах и посевных аппаратах.
3. Совместное выращивание (-*-) и ( ) форм в ферментере. 4. Отделение выращенной биомассы от культуральной жидкости. 5. Сушке каротин (ликопин/содержащей биомассы.• высокое соотношение растворитель : биомасса, применяемое на стадии экстракции, ч приводит к значительному расходу экстрагента. Высокое соотношение биомасса : экстр гент вызвано тем, что растворимость указанных каротиноидов (р-каротин и ликопин) большинстве органических растворителей крайне невысока, более того при наличии в э стракционной смеси даже небольшого количества воды, растворимость каротиноидов еще большей степени падает;
• кристаллизация каротина при пониженной температуре с одновременным высаливание без дополнительного прогрева перед фильтрацией способствует осаждению примесей ми і ровных липидов биомассы одновременно с целевым продуктом, и, как следствие, значі тельно снижает качество получаемых кристаллов каротиноидов;
• использование растворителей (хлор-к-алканы, метанол), недопустимых в пищевы продуктах, а также необходимость создания дистилляционного хозяйства для их регеш рации.
Известен способ получения кристаллического ликопина из биомассы Phycomyces biakesleeanu NRRL 1555 (-) и NRRL 1556 (-+-), который предусматривает, экстракцию липидов смесью раствор? телей метанол ; гексан (1:1), разделение экстракта водой, выделение примесей и продуктов жизн< деятельности гриба-продуцента в водном слое и выделение кристаллов ликопина фильтрацией и остатка, полученного после упаривания гексанового слоя.
Российскими специалистами предложен способ получения ликопина из биомассы гриб BI. trispora. Предложенный способ включает в себя получение биомассы глубинным культивирова нием, полученный мицелий гриба растирают, добавляют ацетон, пропускают через фильтр, отде ляют разрушенную биомассу и получают раствор ацетона ярко-оранжевого цвета с последующи? извлечением из него н-гексаном (более неполярным растворителем) ликопина. Затем полученньп экстракт, выпаривают и получают насыщенный раствор, который подвергают дальнейшее очистке.
Недостаток этого способа заключается в низком выходе кристаллического ликопина, использо вании смеси растворителей и как следствие, относительно высокой стоимости конечного продукта
Эти методы основаны на использовании в процессе экстракции различных органических рас творителей, однако, они обладают все теми же недостатками, основными из которых являете? невысокий выход целевого продукта из биомассы.
р-каротин и ликопин имеют наиболее высокие коэффициенты растворимости в неполярных органических растворителях. Вода, содержащаяся в биомассе микроорганизмов, препятствует проникновению неполярного органического растворителя внутрь клеток. Поэтому с целью достижения более высокой эффективности, в систему вводят полярный растворитель, например спирт, ацетон или тетрагидрофуран, который сольватирует молекулы воды и способствует образованию гомогенной системы; неполярный экстрагент — вода. Такое технологическое решение имеет и свои недостатки, так как в этом случае в результате процесса экстракции образуется обводненная смесь растворителей, регенерация которой требует дополнительных затрат и специального оборудования.
Значительное увеличение выхода кристаллов ликопина, по сравнению с изложенным выше методом, возможно при использовании метода предложенного специалистами ОАО «Уралбиофарм». Высокий выход и качество целевого продукта обеспечивают за счет использования предварительно подсушенной биомассы с влажностью не более 20 %. Использование в предложенном способе подсушенной биомассы (содержание влаги не более 20 %) позволяет экстрагировать ликопин одним неполярным растворителем. Это, во-первых, облегчает процесс экстракции, а , во-вторых, позволяет исключить стадию регенерации этилового спирта, ацетона или другого полярного растворителя из водного раствора, что в итоге приводит к значительному снижению удельного расхода биомассы, растворителей и энергоресурсов.
Экстракцию ликопина из биомассы проводят неполярным органическим растворителем, например, хладоном-11 при температуре от 20 до 26 °С, этилацетатом — от 45 до 65 С или подсолнечным маслом — от 80 до 95°С.
Кристаллизацию и очистку кристаллов ликопина проводят в среде более полярных органических растворителей, например ацетоном или этанолом. Применение на разных стадиях технологического процесса растворителей с различной полярностью, позволяет не использовать смеси растворителей на одной технологической операции, и, кроме того, избежать использования стадии хроматографической очистки кристаллов, так как использование растворителей с различной полярностью позволят получать кристаллы ликопина с содержанием основного вещества 90 -95 %.Известен способ получения кристаллического p-каротина. В соответствии с изобретением, описанным в патенте РФ № 2112808, экстракцию p-каротина из биомассы гриба BI. trispora ведут растительным маслом. Экстракцию начинают в реакторе в соотношении биомасса : растворитель равном 1:3 — 1:15 (мае.) в течение 15-60 мин и завершают на фильтре тем же растворителем, на!’-
257
ретым до 60-90 °С, затем насыщенные экстракты промывают в этиловом спирте в соотношении 10:1 — 3:1 (об.) при 40-55 °С, кристаллизацию ведут при 10—20 °С в течение 1-3 суток. После этого полученную суспензию нагревают до 40—60 °С, кристаллы фильтруют, промывают их этиловым спиртом в соотношении 1:3 — 1:2,5 (мае.) при 50-55 °С. Выход p-каротина составляет 25-27 %, массовая доля р-каротина 90 % . Недостатками способа являются длительность процессов экстракции и кристаллизации, а также значительный расход растворителя на стадии кристаллизации и не высокий выход кристаллов каротина.
Известны также способы получения p-каротина, где на стадии экстракции используют полярные растворителя (спирты, кетоны, некоторые неорганические соединения). Экстракцию липидов из биомассы в этом случае проводят органическими растворителями или их смесями. На следующей стадии выделения отфильтрованую мисцеллу подвергают такому воздействию, при котором диэлектрическая проницаемость раствора повышается. В этих условиях по всему объему мисцеллы происходит образование эмульсии, обусловленное выходом из раствора триглицеридного компонента липидного комплекса.
Эмульсия представляет собой диспергированные в объеме мисцеллы мельчайшие капли триглицеридов. Растворимость каротина в триглицеридах выше по сравнению с растворимостью его в мисцелле, вследствие чего он диффундирует из последней в капельки триглицеридов. Данный способ обеспечивает возможность получения препарата с высоким содержанием триглицеридов и каротина с низким содержанием примесей. Однако способ не предусматривает получения очищенных кристаллов каротина, и более того полученный в предлагаемом способе триглицеридный раствор каротина довольно трудно подвергнуть стандартизации по другим компонентам липидного комплекса гриба BI. trispora (стерины, моно- и диглицериды, жирные кислоты), которые также входят в состав «триглицеридного» раствора каротина.Указанные недостатки устраняются в недавнем патенте, полученном специалистами екатеринбургского завода «Уралбиофарм», в котором предложено для обеспечения строгой стандартизации масляного раствора каротина сначала проводить выделение и очистку кристаллов, а уже на следующей стадии проводить растворение кристаллов в растительном масле. Однако этот способ не предусматривает возможность получения наряду с кристаллами p-каротина других биологически активных соединений, входящих в состав биомассы гриба BI. trispora.
В этой связи, необходимо отметить, что существуют технологии, которые позволяют получать из биомассы микроорганизмов как один, так и несколько целевых продуктов. Последние имеют несомненное преимущество, но применимы только к тем продуцентам, которые способны накапливать в своем составе не один, а несколько ценных биологически активных компонентов.
Следует отметить, что все приведенные выше способы получения каротиноидов из биомассы гриба BI. trispora предусматривают получение в качестве целевого продукта только p-каротина или
Табл. 1. Состав биомассы гриба BI. trispora
| № п/п | Химический состав биомассы | Концентрация |
| 1 | Сухие вещества, % | 92-95 |
| 2 | Влажность, % | 3-5 |
| 3 | Общий белок, % | 20-27 |
| 4 | Липиды,% | 55-67 |
| 5 | Каротиноиды, мг/г | 30-80 |
| 6 | Витамин К, мг/г | 0,002-0,003 |
| 7 | Витамин Е, мг/г | 1,0-2,0 |
| 8 | Кальций, % | 1,5-2,0 |
| 9 | Фосфор, % | 1,8-2,0 |
| Содержание витаминов группы В, мг/кг | ||
| 10 | • тиамин (Bj) | 1,5-2,0 |
| 11 | • рибофлавин (В2) | 150-180 |
| 12 | • пантотеновая кислота (В3) | 30-40 |
| 13 | • никотиновая кислота (В5) | 18-23 |
| 14 | • пиридоксин (Вв) | 14-17 |
| Содержание незаменимых аминокислот, г/кг | ||
| 15 | • лизин | 12,0-15,0 |
| 16 | • метионин | 1,8-2,3 |
| 17 | • триптофан | 0,4-0,5 |
Табл. 2.
Фракционный состав липидов гриба BI. trispora, % от суммы липидов| Показатели | Содержание, % от суммы липидов |
| Фосфолипиды | 18,5-19,5 |
| Моноглицериды | 2,5-3,0 |
| Стерины | 4,2-4,7 |
| Диглицериды | 5,6-6,1 |
| Свободные жирные кислоты | 19,5-20,5 |
| Триглицериды | 45,0-47,0 |
| Суммарные убихиноны, мг/г | 1,0-2,0 |
| Каротиноиды | |
| Р-каротин | 5,7-6,2 |
| Ликопин | 2,5-3,5 |
| Содержание витаминов в липидах | |
| Эргостерин (провитамин D2) | 2,7-2,8 |
| Е, мг/ІООг | 190,0-210,0 |
| К, мг/ЮОг | 0,38-0,42 |
ликопина. Однако биомасса этого продуцента и биолипидный комплекс гриба имеют уникальный состав биологически активных компонентов, которые имеют собственные области применения в пищевой промышленности, медицине и других отраслях (см. табл. 1 и 2).
Как показали исследования направленные на изучение липидов этого продуцента, биолипидный комплекс гриба BI. trispora богат целым рядом жирорастворимых физиологически активных компонентов (см. табл.2).
Как видно из табл. 2, в биолипидном комплексе гриба, кроме р-каротина и ликопина, в значительном количестве обнаружены и другие ценные БАВ: широкий спектр фосфолипидов и жирных кислот нормального строения, эргостерин, убйхиноны.
Необходимо отметить, что в составе фракций жирных кислот преобладают наиболее ценные, имеющие важное физиологическое значение, ненасыщенные жирные кислоты:
• олеиновая (30,1 % )*;
• линолевая (49,7 %)*;
• линоленовая (0,5 %)*.
(* Содержание указано от суммы свободных жирных кислот).
Фосфолипиды, также содержащиеся в значительном количестве в составе биолипидного комплекса гриба BI. trispora, имеют важнейшее физиологическое активное значение. Являясь высо- коспециализированныи липидами, они имеют фундаментальное значение,' как компоненты клеточных мембран и мембран структурных элементов клеток, например таких, как митохондрии, и могут быть названы «эссенциальными» (незаменимыми) для роста, развития и надлежащего функционирования всех соматических клеток. Структура и функция клеточных мембран имеет чрезвычайное значение для здоровья человека. Путем введения фосфолипидов возможно влиять на мембранные функции, связанные с мембранными белками, и исправлять их, по крайней мере, в некоторой степени, а иногда — полностью корректировать нарушенную функцию.
Важное физиологическое значение в организме человека имеют убихиноны. Убихиноны играют существенную роль в важнейших физиологических процессах (транспорт электронов, окислительное фосфорилирование), поэтому считают, что они цо своей биохимической значимости сравнимы с АТФ, НАД и цитохромами, которые принимают участие в процессах синтеза АТФ в клетке и электронном транспорте.
Учитывая такой богатый состав биолипидного комплекса гриба BI. trispora, российскими специалистами была разработана технологическая схема, позволяющая комплексно перерабатывать липиды гриба и расширить таким образом перечень биологически активных веществ, которые возможно получить из биомассы этого продуцента. Такое техническое решение обеспечивает, кроме получения дополнительных ценных продуктов, сокращение расхода реагентов на всех стадиях процесса на единицу конечного продукта. Данная технология позволяет получать в едином технологическом процессе несколько ценных целевых продуктов липидной природы: ликопин, р-каро- тин, убихиноны, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, а так же очищенного от липидов биошрота, как ценной белково-витаминной кормовой добавки в корм сельскохозяйственных животных. При этом достигается более полное использование сырья, что делает данную технологию наиболее конкурентоспособной, за счет снижения себестоимости каж-
259
дого из получаемых компонентов в отдельности. Комплексная технология переработки биомассы гриба BI. trispora с целью получения антиоксидантов и биологически активных веществ липидной природы представлена на рис. 8.
Преимуществом предложенной технологической схемы переработки биомассы является то, что в процессе используется только три органических растворителя: ацетон, гексан, этанол. Причем в схеме не предусмотрено использование значительных количеств смесей растворителей, что значительно облегчает их регенерацию.
Установленные режимы проведения отдельных стадий технологического процесса позволяют максимально извлекать целевые продукты из биомассы продуцента, с наименьшими затратами растворителей, времени и энергоносителей.
Аппаратурная схема процесса включает в основном стандартное химическое оборудование: ai параты с перемешивающими устройствами, роторно-пленочные испарители, емкости для сбор промежуточных продуктов и отстаивания эмульсий, емкостные фильтры для отделения осадкої центробежные шестеренчатые и плунжерные насосы. Нестандартное оборудование составляет н< большую часть от общего числа технологического оборудования и включает адсорбционные колої ки, дистилляторы жирных кислот и гидрозатворы.
Дополнительная литература
1. Авчиев М.И., Буторова И.А., Авчиева П.Б. Изучение особенностей роста и накопления ликопи на парой гетероталличного гриба BI. trispora ВСБ-130(+) и ВСВ-129(-). Биотехнология. — 2003 Т.З. 12-20 стр.
2. Гаврилов А.С., Киселева А.И. и др. Прикладная биохимия и микробиология. — 1996. Т. 32, №5 545-548 стр.
3. Деев С.В., Буторова И.А., Авчиева П.Б. Биотехнология. — 2000. №5. 36-47 стр.
4. Капитонов А.Б., Пимеиов А.М. Успехи современной биологии. — 1996. Т.116. Вып.2 234-244 стр.
5. Кондратьева Е.Н. Фотосинтезирующие бактерии и бактериальный фотосинтез./М. : Изд-ві Моек. Ун-та, — 1972. 76 стр.
6. Сергеев А.В., Вакулова Л.А., Шашкина М.Я., Жидкова Т.А. Вопр. мед. химии. — 1992. № 6 8-12 стр.
7. Стенько А.С., Бондарь И.В., Мацелюх Б.П. Микробиол. журнал. — 1990. Т.52, №3. 47-50 стр.
8. Феофилова Е. П., Терешина В.М., Меморская А.С. Микробиология. — 1995. Т. 64, №6. 734-740 стр.
9. Феофилова Е.П. Прикл. биохимия и микробиол. — 1994. Т.ЗО, N2. — 181-195 стр.
10. Феофилова Е.П. Итоги науки и техники. Сер. Микробиология. — 1991.
11. Феофилова Е.П. Пигменты микроорганизмов./М.: Наука, — 1974. — 218 стр.
12. Патент РФ № 2112808 Cl 6А К 31/05 — 1995.
13. Патент РФ № 213471 Cl 6А К 31/05 — 1999.
14. Canfield L.M., Krinsky N.I., Olsonl.A./Ann. NY Acad. Sci. — 1994. Vol. 691. P. 295.
15. Goodwin T.W. The biochemistry of the carotenoids. 2nd. ed. V. 1. Plants. Champan and Holl. L.: Acad. Press. — 1980.
16. Minthy L., Steven J. Shwartz . Lycopene: Chemical and Biological Properties. Foodtechnology. — 1999. Vol. 53, № 2. P.33-43.
Контрольные вопросы
1. В чем основное отличие процесса культивирования гетероталличного гриба Blakeslea trispora?
2. Что такое изопреноидные соединения? Можно ли отнести р-каротин к этому классу соединений? Ликопин?
3. Какие способы извлечения каротиноидов из биомассы микроорганизмов Вам известны? В чем достоинства и недостатки каждого из них?
4. Что такое антиоксиданты? Какую биологическую роль они играют в организме человека?
5. Какова биологическая роль p-каротина в организме человека? В чем отличие ликопина?
6. Что такое триспоровые кислоты? Какую роль они играют?
7. Какую роль выполняет р-ионон при культивировании гетероталличного гриба Blakeslea trispora'.'
10.