Исследование структур различных белков с применением D2O

Трудно переоценить значение исследований структурно-функциональных особенностей белков живых организмов. К настоящему времени с помощью разнообразных методов исследования накоп­лен огромный объем данных о большом числе «модельных» белков, что позволяет распространять полученные знания на аналогичные менее изученные объекты.

Рассмотрение действия тяжелой воды на белки начнем с упоминания исследования кристалли­зации лизоцима яичного белка. Начальные стадии кристаллизации лизоцима при наличии высо­ких концентраций солей протекают довольно быстро. В недавнем исследовании оценили старто­вый момент агрегации молекул лизоцима, растворенного в природной или тяжелой воде, на фоне высоких концентраций натрия или калия. Было показано, что скорость агрегации в Н₂О не была ион специфична и была ниже, чем в D_aO. Напротив, из раствора D_ZO лизоцим кристаллизовался быстрее при наличии ионов калия. Таким образом, способность белковых молекул лизоцима к аг­регации выше в тяжелой воде.

Исследования крупных белков с использованием метода FTIR (Fourier transform infrared spec­troscopy) более информативны в растворе D₂O. Так при исследовании пространственной организа­ции ингибитора бычьего панкреатического трипсина при давлении до 55 бар отмечались неко­торые изменения конформации только в отдельных участках молекулы, причем все изменения восстанавливались после снятии давления.

Исследования стабильности лекарственных препаратов в различных условиях весьма важны для оценки стратегии их применения. В группе кубинских исследователей, продолжающих рабо­ты по получению и исследованию генно-инженерных интерферонов, использовали метод Н *• D обмена для подтверждения повышения термостабильности этого белка в различных физиологиче­ских условиях.

Интересные результаты дало исследование взаимосвязи между гидратацией (природной и тяже­лой водой) и каталитической активностью белка для субтилизина Карлсберг (B.subtillis). Во всех водно-органических средах, включавших циклогексан, дихлорметан и ацетонирил, активность белка была примерно равной. Обнаружено также, что при повышении степени гидратации и тер­модинамической активности воды, изменяется исходно жесткая структура белка, а также резко повышается его каталитическая активность.

Инфракрасную спектроскопию использовали как метод для изучения структурных изменений и в ходе «разупаковки» РНК-азы А при нагревании в растворах природной и тяжелой воды.

При этих исследованиях также было возможно оценивать Н -» D обмены — по числу амидных про­тонов оставшихся после обработки белка D₂O. Как оказалось, при термоиндуцированном разверты­вании РНК-азы А сначала происходят изменения в p-структурах, потом потери p-спиралей, и лишь затем полная дезорганизация упомянутых a-структур. Кроме того, изучение конформации иссле­дуемого белка при полной изотопной замене Н -» D показало, что частично раскрытые последова­тельности белка лучше стабилизируется гидрофобными взаимодействиями, как и большинство структурированных участков молекулы.

Изучение строения белков методом замены растворителя (Н₂О -» D₂O) многократно продемонст­рировало большие возможности применения этого метода.

Цитохромы играют важную роль в энергетическом обмене клетки, что и способствует постоян­ному вниманию к этим особым белковым объектам. Группа исследователей изучали влиянияе тяжелой воды на нормальный цитохром Р450 и его неактивную «мутантную» форму с единствен­ной аминокислотной заменой Asp₂₅iAsn в каталитическом центре. Эта замена приводила к 100- кратному снижению активности «мутантного» цитохрома, кроме того, к 5-кратному увеличению чувствительности к изотопному эффекту в различных вариантах смеси тяжелой и природной воды. Кристаллографические исследования «мутантного» белка подтвердили, что у него разорва­на ключевая водородная связь, поддерживающая в норме остаток Asp₂₅₁ в требуемом положении. В итоге боковая группировка поворачивается, выходит из зоны сайта связывания О₂ и делает этот сайт более доступным для молекул воды, что и вызывает сильный изотопный эффект D₂O.

Можно привести еще один пример успешного сочетания генетических методов, направленных изменения цитохромов, в сочетании с методами изотопных исследований (замена Н₂0 на D₂O). Именно так удалось установить ключевую роль глютаминовой кислоты (Glu₂₇₈) I субъединицы ци­тохрома с в редокс реакции. Более того, зафиксировали различия в степени доступности карбок­сильных группировок боковой цепи к сети водородных связей в двух редокс состояниях молекулы цитохрома ЬоЗ, что подтвердило прохождение конформационных изменений внутри D-канала с аминокислотным остатком Glu₂₈₆, наблюдающихся при переходе к окисленной форме.

Разнообразные вопросы решаются сегодня с применением дейтериевой метки при исследовании «обычных» биосинтетических белков. Данный подход позволил, например, разработать модели химических реакций диаминопимелатной ветви аминокислотного метаболизма. Как известно, эти реакции тесно смыкаются с синтезом лизина, а также с синтезом пентапептида пептидоглюкана грамотрицательных микроорганизмов. При исследовании эпимеразы, образующей D.L-диамино- пимелат из соответствующего £,£-изомера, определили, что прямая L,L —D.L я обратная D,L --L,L реакции контролируется единственной каталитической группой, имеющей рК 7,0 и 6,1, соответст­венно, и что эта группа в активной форме должна быть непротонированной. При замене раствори­теля на D₂O обнаружили парадоксальный факт: при инкубации L.L-диаминопимелата с ферментом наблюдается единственный «перескок» L,L ->■ D,L, тогда как в аналогичных условиях с D.L-диами- нопимелатом — беспрецедентный двойной, что внешне выглядит как отсутствие реакции. Изо­топные методы исследования позволили предложить модель, по которой изомеризация протона крайне важна для обеспечения кинетических параметров катализа и диссоциации, а также зафик­сировать цинк-зависимость смежного фермента (десукцинилазы) и изучить субстратную специ­фичность этого металлофермента.

Еще один пример удачного использования D₂O для изучения эпимеразной реакции — работа по установления функции белка, кодируемого структурным геном rmIC Mycobacterium tuberculosis. Ранее было известно, что в клетках Е. coli dTDP-рамноза образуется из глюкозо-1-фосфата и dTTP в серии из четырех последовательных реакций, катализируемых продуктами генов rmlA, rmlB, rmIC и rmID. У мутантов rmIC теряется способность образовывать dTDP-4-кето-рамнозу в бескле­точном экстракте. Эта способность восстанавливается при добавлении экстракта клеток дикого типа и dTDP-глюкозы, т. е. dTDP-4-кето-рамноза может существовать в клетках в виде свободного интермедиата. При проведении этой реакции в тяжелой воде продукт гена rmIC дикого типа обес­печивает включение в состав молекулы dTDP-4-кето-рамнозы двух атомов дейтерия — в положе ния СЗ' и С5'.

Белково-нуклеиновые взаимодействия, как известно, играют ключевую роль в регуляции генетических процессов. Соответственно, изучение особенностей тонких механизмов взаимо­действия тех или иных регуляторных белков и регуляторных фрагментов нуклеиновых кис­лот — важнейшая задача современной молекулярной генетики. Возможности использования тяжелой воды для получения новых данных в такого рода исследованиях были продемонстри­рованы недавно на модели ц-АМФ связывающего белка (CRP). Авторы изучали термодинами­ку процесса взаимодействия белка CRP, а также его «мутантных» форм, с тремя 40-членными фрагментами ДНК, отвечающими за узнавание и связывание с этим белком в трех разных опе- ронах кишечной палочки. Замена растворителя, в котором проводились исследования, на D₂O обнаружила значительное возрастание теплоемкости реакций взаимодействия, что позволило сделать вывод о важности дегидратации в этом процессе. Кроме того, в данной работе с помо­щью метода рассеяния нейтронов прямо показано, что молекулы ДНК изгибаются вокруг ком­плекса ц-АМФ-CRP.

3.4.